Ici, nous démontrons une procédure relativement simple et directe pour assembler des réseaux d’actomyosine attachés à la membrane et étudier la dynamique à l’aide de techniques avancées de microscopie optique. Le principal avantage est que notre test permet l’ajout séquentiel de protéines et de petites molécules sans perturber les réseaux attachés à la membrane. Cette méthode peut être facilement adaptée pour étudier d’autres protéines cytosquelettiques ou des réseaux composites.
La partie la plus critique du protocole est de s’assurer que la bicouche lipidique supportée est formée correctement, donc d’abord, nous avons dû maîtriser cette étape avant de commencer à ajouter les protéines cytosquelettiques. Pour commencer, prenez trois à cinq lamelles de verre rectangulaires et placez-les dans un pot de colin. Allumez le sonicateur de bain et réglez la température à 65 degrés Celsius.
Remplissez le pot de coplin avec une solution de nettoyage à 2% pour immerger complètement les lamelles de couverture et placez-le dans le sonicateur pendant 30 minutes en mode pleine impulsion. Utilisez des pinces émoussées revêtues de PTFE pour retirer les lamelles de couvercle une par une. Rincez-les abondamment à l’eau distillée et placez-les dans un autre pot de coplin rempli de deux hydroxydes de sodium normaux.
Sonicer les lames de couverture pendant 20 minutes en mode pleine impulsion. Retirez les lames de couverture, rincez abondamment à l’eau distillée et placez-les dans un autre pot de coplin rempli d’eau distillée. Avant de commencer l’expérience, prenez le pot dans une hotte chimique équipée d’une alimentation en azote gazeux.
Utilisez des gants et des pinces pour retirer les lamelles de couverture afin de les sécher sous le jet d’azote. Séchez les deux côtés et placez-les sur une grille en plastique propre avec un couvercle. Placez la boîte avec les lamelles de couverture dans un dessiccateur pour éviter tout contact avec des particules de poussière, puis prenez des tubes PCR autoclavés et découpez leurs couvercles et leurs moitiés coniques inférieures avec une lame chirurgicale tranchante.
Prenez les tubes cylindriques demi-coupés, appliquez un adhésif durcissable aux UV sur le bord lisse de chaque tube coupé et placez-le inversé sur un couvercle fraîchement nettoyé de sorte que le bord repose à plat sur le couvercle. Ne déplacez pas le cylindre latéralement une fois qu’il est positionné sur la lamelle de couverture pour vous assurer que la colle ne se répand pas dans l’espace central de la chambre. Placez les lamelles de recouvrement du roulement de la chambre à l’intérieur d’un nettoyeur à ozone UV avec une alimentation en oxygène et un aspirateur.
Allumez la lumière UV et allumez-la pendant trois à cinq minutes pour permettre à l’adhésif de polymériser. Retirez les lamelles de couverture et testez les chambres pour détecter les fuites, et jetez les chambres qui fuient. Lavez chaque chambre avec un tampon de formation SLB, en laissant 100 microlitres de tampon à la fin.
Marquez le niveau du tampon à 100 microlitres avec un marqueur permanent, puis ajoutez deux microlitres de chlorure de calcium 0,1 molaire dans la chambre, suivis de huit microlitres de la solution SUV dans chaque chambre et incuber pendant 15 minutes à 25 degrés Celsius. Retirez 50 microlitres du tampon de formation SLB, en ne laissant que 50 microlitres dans la chambre d’échantillonnage, puis ajoutez 100 microlitres d’un XKMEH dans la chambre et mélangez doucement. Retirez 100 microlitres du tampon sans toucher le fond.
Répétez les lavages huit à 10 fois en ajoutant 100 microlitres d’un XKMEH et en retirant 100 microlitres. Ajouter 10 microlitres d’un milligramme par millilitre de bêta-caséine à la bicouche, mélanger doucement et incuber pendant cinq à 10 minutes à température ambiante. Laver la caséine bêta trois fois avec un XKMEH et ramener le niveau de tampon à la marque des 100 microlitres.
Pendant l’incubation de la caséine bêta, retirez une partie aliquote de la protéine de liaison membrane-actine pour moins 80 degrés Celsius décongelée rapidement à 37 degrés Celsius, puis conservez-la sur la glace. Diluer l’aliquote avec un tampon de dilution protéique jusqu’à une concentration d’une micromolaire. Ajouter la protéine de liaison à la solution à une concentration finale définie et mélanger doucement.
Incuber pendant 30 à 40 minutes à température ambiante et laver trois à cinq fois avec un tampon XKMEH pour éliminer la protéine HSE non liée. Ramenez le niveau tampon dans chaque chambre à la marque des 100 microlitres. L’échantillon est maintenant prêt pour l’imagerie.
Allumez le microscope, les lasers d’excitation et les caméras de détection. Assurez-vous que le laser est aligné, que l’objectif est nettoyé et que le logiciel est prêt à acquérir des images. Mettez de l’huile sur l’objectif 100 fois, montez l’échantillon sur la platine du microscope et concentrez l’objectif sur la bicouche.
Assurez-vous que la position du laser est telle qu’il subisse une réflexion interne totale sur l’échantillon. Utilisez une excitation de 488 nanomètres. Pour déterminer l’intégrité de la bicouche, effectuez un test FRAP rapide en sélectionnant une région d’intérêt sur la bicouche et en enregistrant quelques images du champ de vision en utilisant des conditions d’imagerie qui fournissent un rapport signal sur bruit de cinq à un ou plus.
Mettez l’enregistrement en pause et fermez le diaphragme de champ du microscope TIRF pour concentrer un faisceau laser concentré sur une petite région circulaire de la bicouche afin de blanchir localement les fluorophores. Allumez le laser à sa sortie maximale pour photoblanchir la petite région pendant trois à 10 secondes, puis éteignez le laser. Rouvrez le diaphragme de champ à son rayon d’origine, réajustez l’état d’imagerie aux paramètres pré-blanchiment et reprenez immédiatement l’enregistrement de la récupération du signal fluorescent dans le champ de vision.
Vérifiez si la bicouche est fluide et enregistrez les images sous forme de fichiers TIF à points 16 bits. Mélangez la G-actine non marquée et marquée par fluorescence dans un rapport molaire de 10 à un, et complétez-la avec un tampon G de sorte que la concentration de G-actine soit de 20 micromolaires. Ajouter un dixième de 10 fois le tampon ME au mélange pour une solution unique, et incuber pendant deux minutes à température ambiante.
Ensuite, décongelez rapidement le flacon de bouillon de protéines à 37 degrés Celsius, puis conservez-le sur la glace. Diluer avec des tampons G de telle sorte que la concentration de protéine de coiffage soit maintenant deux fois sa concentration finale souhaitée, puis ajouter un volume égal de la solution de protéine de coiffage diluée au mélange d’actine. Enfin, ajoutez un volume égal de tampon frais deux fois cible au mélange réactionnel.
Le volume final de la solution doit être quatre fois le volume du mélange d’actine. Assurez-vous que la concentration finale des composants est telle que décrite dans le manuscrit du texte. Incuber les échantillons dans l’obscurité à 25 degrés Celsius pendant 45 à 60 minutes pour permettre la polymérisation.
Extraire doucement à la pipette cinq actines polymérisées micromolaires avec une pointe de pipette émoussée et l’ajouter à un tube de PCR autoclavé propre. Ajouter un XKMEH au tube pour faire le volume final plus de 20 microlitres, et mélanger doucement pour éviter de cisailler la F-actine. De la chambre d’échantillonnage montée, retirez un volume égal du tampon.
Ajouter la solution d’actine polymérisée dans la chambre et pipeter doucement de haut en bas trois fois sans toucher la bicouche au fond. Montez l’échantillon sur le microscope TIRF et laissez-le reposer pendant 20 à 30 minutes. Enregistrez quelques images de différents champs de vision après que l’ajout de F-actine ait atteint un état stable.
Après 30 minutes d’incubation d’actine, remontez l’échantillon sur le microscope. Vérifiez le signal sur la protéine de liaison et les canaux F-actine. Ajustez les conditions d’imagerie si nécessaire.
Sélectionnez une bonne région pour un enregistrement en accéléré de longue durée. Enregistrez 10 à 15 images de 0,1 à 0,2 hertz avant l’ajout de myosine et mettez l’enregistrement en pause. Extraire à la pipette le volume requis de myosine musculaire recyclée deux du flacon d’origine à l’aide d’une pointe de pipette émoussée et l’ajouter à un tube PCR autoclavé propre.
Ajouter immédiatement un XKMEH dans le tube pour faire le volume plus de 20 microlitres, et mélanger doucement. Retirez délicatement un volume égal du tampon KMEH de la chambre d’échantillonnage montée sans la déranger, et ajoutez doucement la solution de myosine dans la chambre d’échantillonnage. Ne pas pipeter de haut en bas, car cela perturberait les filaments liés à la surface.
Reprenez immédiatement l’enregistrement en accéléré et enregistrez toutes les images, puis prenez des images d’arrière-plan pour tous les canaux à l’aide d’un échantillon de mémoire tampon uniquement. Enregistrez toutes les images en tant que fichiers TIF. La valeur ajustée du coefficient de diffusion était de 1,34 micromètre carré par seconde, ce qui correspondait étroitement à la valeur calculée sur la base d’une formule de 1,39 micromètre carré par seconde.
Le profil linéaire après photoblanchiment et le profil de récupération de la région blanchie correspondent respectivement aux équations quatre et cinq. La fraction mobile de la bicouche lipidique représentant la fraction de la population blanchie qui se rétablit était supérieure à 0,9, indiquant une bonne bicouche lipidique. L’activité de la myosine a induit des flux d’actomyosine contractile qui ont émergé dans des structures astro-semblables à l’état d’équilibre, entraînant un regroupement local du composant membranaire couplé.
On peut utiliser une variété de techniques de microscopie telles que la microscopie à diffusion interférométrique pour étudier la dynamique des réseaux d’actomyosine non marqués sans induire de dommages photo, ou utiliser la microscopie à fluorescence à super résolution. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs intéressés à comprendre comment les complexes protéiques membranaires interagissent avec un réseau dynamique d’actomyosine pour moduler leur architecture et leur composition.
