Hier demonstrieren wir ein relativ einfaches und unkompliziertes Verfahren, um membrangebundene Actomyosin-Netzwerke aufzubauen und die Dynamik mit fortschrittlichen lichtmikroskopischen Techniken zu untersuchen. Der entscheidende Vorteil ist, dass unser Assay die sequentielle Addition von Proteinen und kleinen Molekülen ermöglicht, ohne die membrangebundenen Netzwerke zu stören. Diese Methode kann leicht angepasst werden, um andere Zytoskelettproteine oder zusammengesetzte Netzwerke zu untersuchen.
Der kritischste Teil des Protokolls besteht darin, sicherzustellen, dass die unterstützte Lipiddoppelschicht korrekt gebildet wird, daher mussten wir diesen Schritt zuerst beherrschen, bevor wir mit der Zugabe der Zytoskelettproteine beginnen konnten. Nehmen Sie zunächst drei bis fünf rechteckige Glasdeckgläser und legen Sie sie in ein Koplinglas. Schalten Sie den Badsonikator ein und stellen Sie die Temperatur auf 65 Grad Celsius ein.
Füllen Sie das Kapplinglas mit 2% Reinigungslösung, um die Deckgläser vollständig einzutauchen, und legen Sie es für 30 Minuten im vollen Pulsmodus in den Sonicator. Verwenden Sie stumpfe PTFE-beschichtete Pinzetten, um die Deckgläser einzeln zu entfernen. Spülen Sie sie gründlich mit destilliertem Wasser ab und stellen Sie sie in ein anderes Koplinglas, das mit zwei normalen Natriumhydroxiden gefüllt ist.
Beschallen Sie die Deckgläser für 20 Minuten im vollen Pulsmodus. Entfernen Sie die Deckgläser, spülen Sie sie gründlich mit destilliertem Wasser ab und stellen Sie sie in ein anderes mit destilliertem Wasser gefülltes Tuch. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, nehmen Sie das Glas in eine chemische Haube, die mit einer Stickstoffgasversorgung ausgestattet ist.
Verwenden Sie Handschuhe und Pinzetten, um die Deckgläser zu entfernen, um sie unter dem Stickstoffstrom zu trocknen. Trocknen Sie beide Seiten und legen Sie sie auf ein sauberes Kunststoffgitter mit einer Abdeckung. Legen Sie die Box mit den Deckgläsern in einen Exsikkator, um den Kontakt mit Staubpartikeln zu vermeiden, nehmen Sie dann autoklavierte PCR-Röhrchen und schneiden Sie ihre Deckel und unteren konischen Hälften mit einer scharfen chirurgischen Klinge aus.
Nehmen Sie die zylindrischen halbgeschnittenen Tuben, tragen Sie UV-härtenden Klebstoff auf den glatten Rand jedes geschnittenen Röhrchens auf und legen Sie ihn umgekehrt auf ein frisch gereinigtes Deckglas, so dass der Rand flach auf dem Deckglas sitzt. Bewegen Sie den Zylinder nicht seitlich, sobald er auf dem Deckglas positioniert ist, um sicherzustellen, dass der Klebstoff nicht in den zentralen Raum der Kammer gelangt. Legen Sie die Kammer mit Deckgläsern in einen UV-Ozonreiniger mit Sauerstoffzufuhr und Vakuum.
Schalten Sie das UV-Licht ein und beleuchten Sie es drei bis fünf Minuten, damit der Klebstoff polymerisieren kann. Nehmen Sie die Deckgläser heraus und testen Sie die Kammern auf Leckagen und entsorgen Sie die undichten Kammern. Waschen Sie jede Kammer mit SLB-Formationspuffer, wobei am Ende 100 Mikroliter Puffer übrig bleiben.
Markieren Sie den Pufferspiegel bei 100 Mikrolitern mit einem Permanentmarker, geben Sie dann zwei Mikroliter 0,1 molares Calciumchlorid in die Kammer, gefolgt von acht Mikrolitern der SUV-Lösung in jede Kammer und inkubieren Sie für 15 Minuten bei 25 Grad Celsius. Entfernen Sie 50 Mikroliter des SLB-Formationspuffers, lassen Sie nur 50 Mikroliter in der Probenkammer, geben Sie dann 100 Mikroliter eines XKMEH in die Kammer und mischen Sie vorsichtig. Entfernen Sie 100 Mikroliter des Puffers, ohne den Boden zu berühren.
Wiederholen Sie die Wäschen acht bis 10 Mal, indem Sie 100 Mikroliter eines XKMEH hinzufügen und 100 Mikroliter entfernen. 10 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter Beta-Casein in die Doppelschicht geben, vorsichtig mischen und fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Beta-Casein dreimal mit einem XKMEH abwaschen und den Pufferspiegel wieder auf die 100-Mikroliter-Marke bringen.
Nehmen Sie während der Beta-Casein-Inkubation ein Aliquot Membran-Aktin-Linkerprotein für minus 80 Grad Celsius, das schnell bei 37 Grad Celsius aufgetaut ist, und halten Sie es dann auf Eis. Das Aliquot wird mit einem Proteinverdünnungspuffer auf eine Konzentration von einem Mikromolaren verdünnt. Das Linkerprotein in einer definierten Endkonzentration in die Lösung geben und vorsichtig mischen.
30 bis 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und drei- bis fünfmal mit einem XKMEH-Puffer waschen, um das ungebundene HSE-Protein zu entfernen. Bringen Sie den Pufferstand in jeder Kammer wieder auf die 100-Mikroliter-Marke. Die Probe ist nun bereit für die Bildgebung.
Schalten Sie das Mikroskop, die Anregungslaser und die Detektionskameras ein. Stellen Sie sicher, dass der Laser ausgerichtet ist, das Objektiv gereinigt wird und die Software bereit ist, Bilder aufzunehmen. Öl auf das 100-fache Objektiv geben, die Probe auf den Mikroskoptisch montieren und das Objektiv auf die Doppelschicht fokussieren.
Stellen Sie sicher, dass die Laserposition so ist, dass sie eine vollständige interne Reflexion auf der Probe erfährt. Verwenden Sie eine 488-Nanometer-Anregung. Um die Integrität der Doppelschicht zu bestimmen, führen Sie einen schnellen FRAP-Assay durch, indem Sie einen Bereich von Interesse auf der Doppelschicht auswählen und einige Bilder des Sichtfelds unter Verwendung von Bildgebungsbedingungen aufzeichnen, die ein Signal-Rausch-Verhältnis von fünf zu eins oder höher liefern.
Pausieren Sie die Aufnahme und schließen Sie die Feldmembran des TIRF-Mikroskops, um einen konzentrierten Laserstrahl auf einen kleinen kreisförmigen Bereich der Doppelschicht zu fokussieren, um die Fluorophore lokal zu bleichen. Schalten Sie den Laser auf seine maximale Leistung ein, um den kleinen Bereich für drei bis 10 Sekunden zu photobleichen, und schalten Sie dann den Laser aus. Öffnen Sie die Feldblende wieder auf ihren ursprünglichen Radius, stellen Sie den Bildgebungszustand wieder auf die Einstellungen vor dem Bleichmittel ein und setzen Sie sofort die Aufzeichnung der Wiederherstellung des Fluoreszenzsignals im Sichtfeld fort.
Überprüfen Sie, ob die Doppelschicht flüssig ist, und speichern Sie die Bilder als 16-Bit-Punkt-TIF-Dateien. Mischen Sie unmarkiertes und fluoreszierend markiertes G-Aktin in einem Verhältnis von 10 zu eins und füllen Sie es mit G-Puffer auf, so dass die Konzentration von G-Aktin 20 Mikromolar beträgt. Fügen Sie der Mischung ein Zehntel des 10-fachen ME-Puffers für eine einmalige Lösung hinzu und inkubieren Sie zwei Minuten bei Raumtemperatur.
Als nächstes tauen Sie die Durchstechflasche mit dem Deckeln der Proteinbrühe schnell bei 37 Grad Celsius auf und halten Sie sie dann auf Eis. Mit G-Puffern so verdünnen, dass die Konzentration des Capping-Proteins jetzt doppelt so hoch ist wie die gewünschte Endkonzentration, und dann ein gleiches Volumen der verdünnten Capping-Proteinlösung zur Aktinmischung geben. Schließlich fügen Sie der Reaktionsmischung ein gleiches Volumen frischen, zweifachen Zielpuffers hinzu.
Das Endvolumen der Lösung sollte das Vierfache des Volumens der Aktinmischung betragen. Stellen Sie sicher, dass die endgültige Konzentration der Komponenten wie im Textmanuskript beschrieben ist. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei 25 Grad Celsius für 45 bis 60 Minuten, um die Polymerisation zu ermöglichen.
Pipettieren Sie vorsichtig fünf mikromolar polymerisiertes Aktin mit einer stumpfen Pipettenspitze und geben Sie es in ein sauberes autoklaviertes PCR-Röhrchen. Fügen Sie ein XKMEH in das Röhrchen hinzu, um das Endvolumen mehr als 20 Mikroliter zu erreichen, und mischen Sie vorsichtig, um ein Scheren von F-Aktin zu vermeiden. Entfernen Sie aus der montierten Probenkammer ein gleiches Volumen des Puffers.
Fügen Sie die polymerisierte Aktinlösung in die Kammer hinzu und pipetten Sie dreimal vorsichtig auf und ab, ohne die Doppelschicht am Boden zu berühren. Montieren Sie die Probe auf dem TIRF-Mikroskop und lassen Sie sie 20 bis 30 Minuten ruhen. Nehmen Sie einige Bilder aus verschiedenen Sichtfeldern auf, nachdem F-Actin zusätzlich einen stabilen Zustand erreicht hat.
Nach 30 Minuten Aktininkubation montieren Sie die Probe wieder auf das Mikroskop. Überprüfen Sie das Signal auf den Linkerprotein- und F-Aktin-Kanälen. Passen Sie die Bildgebungsbedingungen bei Bedarf an.
Wählen Sie eine gute Region für eine lange Zeitrafferaufnahme. Nehmen Sie 10 bis 15 Bilder mit 0,1 bis 0,2 Hertz vor Myosin auf und pausieren Sie die Aufnahme. Pipettieren Sie das erforderliche Volumen an recyceltem Muskelmyosin zwei aus der Durchstechflasche mit einer stumpfen Pipettenspitze und fügen Sie es in ein sauberes autoklaviertes PCR-Röhrchen hinzu.
Fügen Sie sofort einen XKMEH in die Tube hinzu, um das Volumen mehr als 20 Mikroliter zu erhöhen, und mischen Sie vorsichtig. Entfernen Sie vorsichtig ein gleiches Volumen des KMEH-Puffers aus der montierten Probenkammer, ohne sie zu stören, und geben Sie die Myosinlösung vorsichtig in die Probenkammer. Pipettieren Sie nicht nach oben und unten, da dies die oberflächengebundenen Filamente stört.
Setzen Sie die Zeitrafferaufnahme sofort fort, speichern Sie alle Bilder und nehmen Sie dann Hintergrundbilder für alle Kanäle mit einem reinen Puffersample auf. Speichern Sie alle Bilder als TIF-Dateien. Der angepasste Wert des Diffusionskoeffizienten betrug 1,34 Quadratmikrometer pro Sekunde, was eng mit dem formelbasierten berechneten Wert von 1,39 Quadratmikrometern pro Sekunde übereinstimmte.
Das Linienprofil nach dem Photobleaching und das Erholungsprofil des gebleichten Bereichs passen zu den Gleichungen vier bzw. fünf. Der mobile Anteil der Lipiddoppelschicht, der den Anteil der gebleichten Population darstellt, der sich wieder erholt, war größer als 0,9, was auf eine gute Lipiddoppelschicht hinweist. Myosinaktivität induzierte kontraktile Actomyosin-Ströme, die im stationären Zustand zu astroähnlichen Strukturen auftraten und die lokale Clusterbildung der gekoppelten Membrankomponente antreiben.
Man kann eine Vielzahl von Mikroskopietechniken wie interferometrische Streumikroskopie verwenden, um die Dynamik von unmarkierten Actomyosin-Netzwerken zu untersuchen, ohne Photoschäden zu verursachen, oder hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie verwenden. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, die verstehen möchten, wie Membranproteinkomplexe mit einem dynamischen Actomyosin-Netzwerk interagieren, um ihre Architektur und Zusammensetzung zu modulieren.
