Burada, membrana bağlı aktomiyozin ağlarını bir araya getirmek ve gelişmiş ışık mikroskobik teknikleri kullanarak dinamikleri incelemek için nispeten basit ve anlaşılır bir prosedür gösteriyoruz. En önemli avantajı, tahlilimizin, membrana bağlı ağları bozmadan proteinlerin ve küçük moleküllerin sıralı olarak eklenmesine izin vermesidir. Bu yöntem, diğer sitoiskelet proteinlerini veya kompozit ağları incelemek için kolayca uyarlanabilir.
Protokolün en kritik kısmı, desteklenen lipit çift katmanının doğru bir şekilde oluşmasını sağlamaktır, bu nedenle ilk olarak, sitoiskelet proteinlerini eklemeye başlamadan önce bu adımda ustalaşmamız gerekiyordu. Başlamak için, üç ila beş dikdörtgen cam kapak kapağı alın ve bunları bir coplin kavanozunun içine yerleştirin. Banyo sonicator'u açın ve sıcaklığı 65 santigrat dereceye ayarlayın.
Kapak kapaklarını tamamen suya batırmak için coplin kavanozu% 2 temizleme çözeltisi ile doldurun ve tam darbe modunda 30 dakika boyunca sonikatöre yerleştirin. Kapak kapaklarını tek tek çıkarmak için künt PTFE kaplı forseps kullanın. Damıtılmış suyla iyice durulayın ve iki normal sodyum hidroksit ile doldurulmuş başka bir coplin kavanozuna yerleştirin.
Tam darbe modunda kapakları 20 dakika boyunca sonikleştirin. Kapak kapaklarını çıkarın, damıtılmış suyla iyice durulayın ve damıtılmış suyla doldurulmuş başka bir coplin kavanozuna yerleştirin. Deneye başlamadan önce, kavanozu azot gazı beslemesi ile donatılmış kimyasal bir davlumbaza alın.
Eldiven ve forseps kullanarak nitrojen akımı altında kurutmak üzere kapak kapaklarını çıkarın. Her iki tarafı da kurutun ve kapaklı temiz bir plastik ızgaraya yerleştirin. Toz parçacıklarıyla teması önlemek için kapak kapaklı kutuyu bir kurutucuya yerleştirin, ardından otoklavlanmış PCR tüplerini alın ve kapaklarını ve alt konik yarılarını keskin bir cerrahi bıçakla kesin.
Silindirik yarım kesilmiş tüpleri alın, her bir kesilmiş tüpün pürüzsüz kenarına UV kürlenebilir yapıştırıcı uygulayın ve yeni temizlenmiş bir kapak kapağı üzerine ters çevrilmiş olarak yerleştirin, böylece jant kapak kayması üzerine düz oturur. Tutkalın odanın merkezi boşluğuna dökülmemesini sağlamak için silindiri kapak kapağına yerleştirildikten sonra yanal olarak hareket ettirmeyin. Oda yatak kapaklarını oksijen beslemeli ve vakumlu bir UV ozon temizleyicinin içine yerleştirin.
UV ışığını açın ve yapıştırıcının polimerleşmesine izin vermek için üç ila beş dakika aydınlatın. Kapak fişlerini çıkarın ve odaları sızıntı açısından test edin ve sızdıran odaları atın. Her odayı SLB oluşum tamponu ile yıkayın ve sonunda 100 mikrolitre tampon bırakın.
Tamponun seviyesini kalıcı bir işaretleyici ile 100 mikrolitrede işaretleyin, ardından odaya iki mikrolitre 0.1 molar kalsiyum klorür ekleyin, ardından her odaya sekiz mikrolitre SUV çözeltisi ekleyin ve 25 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. SLB oluşum tamponunun 50 mikrolitresini çıkarın, numune haznesinde sadece 50 mikrolitre bırakın, ardından odaya 100 mikrolitre bir XKMEH ekleyin ve yavaşça karıştırın. Tamponun 100 mikrolitresini tabana dokunmadan çıkarın.
Bir XKMEH'in 100 mikrolitresini ekleyerek ve 100 mikrolitreyi çıkararak yıkamaları sekiz ila 10 kez tekrarlayın. İki katmana mililitre beta-kazein başına 10 mikrolitre bir miligram ekleyin, yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika kuluçkaya yatırın. Beta-kazeini bir XKMEH ile üç kez yıkayın ve tampon seviyesini 100 mikrolitre işaretine geri getirin.
Beta-kazein inkübasyonu sırasında, eksi 80 santigrat derece için 37 santigrat derecede hızla çözülmüş bir membran-aktin bağlayıcı protein aliquot alın ve daha sonra buz üzerinde tutun. Aliquot'u protein seyreltme tamponu ile bir mikromolar konsantrasyonuna seyreltin. Bağlayıcı proteini tanımlanmış bir son konsantrasyonda çözeltiye ekleyin ve yavaşça karıştırın.
Oda sıcaklığında 30 ila 40 dakika inkübe edin ve bağlanmamış HSE proteinini çıkarmak için bir XKMEH tamponu ile üç ila beş kez yıkayın. Her odadaki tampon seviyesini 100 mikrolitre işaretine geri getirin. Örnek artık görüntüleme için hazırdır.
Mikroskopu, uyarma lazerlerini ve algılama kameralarını açın. Lazerin hizalandığından, hedefin temizlendiğinden ve yazılımın görüntü almaya hazır olduğundan emin olun. Yağı 100 kez hedefe koyun, numuneyi mikroskop aşamasına monte edin ve hedefi çift katmana odaklayın.
Lazer pozisyonunun, numune üzerinde toplam iç yansımaya maruz kalacak şekilde olduğundan emin olun. 488 nanometre uyarım kullanın. İki katmanın bütünlüğünü belirlemek için, çift katmanlı üzerinde bir ilgi alanı seçerek ve beş ila bir veya daha yüksek bir sinyal-gürültü oranı sağlayan görüntüleme koşullarını kullanarak görüş alanının birkaç görüntüsünü kaydederek hızlı bir FRAP testi gerçekleştirin.
Kaydı duraklatın ve floroforları yerel olarak ağartmak için çift katmanın küçük bir dairesel bölgesine konsantre bir lazer ışını odaklamak için TIRF mikroskobunun alan diyaframını kapatın. Küçük bölgeyi üç ila 10 saniye boyunca fotobeyazlatmak için lazeri maksimum çıkışına kadar açın ve ardından lazeri kapatın. Alan diyaframını orijinal yarıçapına yeniden açın, görüntüleme durumunu tekrar ağartıcı öncesi ayarlara yeniden ayarlayın ve floresan sinyalin geri kazanımını görüş alanına kaydetmeye hemen devam edin.
Çift katmanın akıcı olup olmadığını kontrol edin ve görüntüleri 16 bit nokta TIF dosyaları olarak kaydedin. Etiketlenmemiş ve floresan olarak etiketlenmiş G-aktin'i 10 ila bir molar oranında karıştırın ve G-aktin konsantrasyonunun 20 mikromolar olması için G-tamponu ile doldurun. Bir kerelik bir çözelti için karışıma 10 kat ME tamponunun onda birini ekleyin ve oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin.
Daha sonra, kapak proteini stoğunun şişesini 37 santigrat derecede hızlı bir şekilde çözün ve ardından buz üzerinde tutun. G-tamponları ile seyreltin, böylece kapak proteininin konsantrasyonu şimdi istenen nihai konsantrasyonun iki katı olacaktır, daha sonra seyreltilmiş kapak proteini çözeltisinin eşit bir hacmini aktin karışımına ekleyin. Son olarak, reaksiyon karışımına eşit miktarda taze iki kat hedef tampon ekleyin.
Çözeltinin son hacmi, aktin karışımının hacminin dört katı olmalıdır. Bileşenlerin son konsantrasyonunun metin makalesinde açıklandığı gibi olduğundan emin olun. Polimerizasyona izin vermek için örnekleri karanlıkta 25 santigrat derecede 45 ila 60 dakika boyunca inkübe edin.
Künt uçlu pipet ucu ile beş mikromolar polimerize aktini nazikçe pipetleyin ve temiz bir otoklavlanmış PCR tüpüne ekleyin. Son hacmi 20 mikrolitreden fazla yapmak için tüpe bir XKMEH ekleyin ve F-aktin'in kesilmesini önlemek için hafifçe karıştırın. Monte edilmiş numune odasından, tamponun eşit hacmini çıkarın.
Polimerize aktin çözeltisini odaya ekleyin ve alttaki çift katmana dokunmadan yavaşça yukarı ve aşağı üç kez pipet çekin. Numuneyi TIRF mikroskobuna monte edin ve 20 ila 30 dakika dinlendirin. F-actin ilavesi sabit bir duruma ulaştıktan sonra farklı görüş alanlarından birkaç görüntü kaydedin.
30 dakikalık aktin inkübasyonundan sonra, numuneyi tekrar mikroskopa monte edin. Bağlayıcı protein ve F-aktin kanallarındaki sinyali kontrol edin. Gerekirse görüntüleme koşullarını ayarlayın.
Uzun bir hızlandırılmış kayıt için iyi bir bölge seçin. Miyozin ilavesinden önce 0,1 ila 0,2 hertz'de 10 ila 15 kare kaydedin ve kaydı duraklatın. Künt uçlu pipet ucu ile stok şişesinden gerekli miktarda geri dönüştürülmüş kas miyozin ikisini pipetle çıkarın ve temiz bir otoklavlanmış PCR tüpüne ekleyin.
Hacmi 20 mikrolitreden fazla yapmak için hemen tüpe bir XKMEH ekleyin ve yavaşça karıştırın. KMEH tamponunun eşit hacmini monte edilmiş numune odasından rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın ve miyozin çözeltisini numune odasına yavaşça ekleyin. Yüzeye bağlı filamentleri rahatsız edeceğinden yukarı ve aşağı pipet yapmayın.
Hızlandırılmış kaydı hemen sürdürün ve tüm görüntüleri kaydedin, ardından yalnızca arabellek örneği kullanarak tüm kanallar için arka plan görüntüleri alın. Tüm görüntüleri TIF dosyaları olarak kaydedin. Difüzyon katsayısının takılı değeri saniyede 1.34 kare mikrometre idi ve bu da saniyede 1.39 metrekarelik formüle dayalı hesaplanan değerle yakından uyuşuyordu.
Fotobeyazlatma sonrası çizgi profili ve ağartılmış bölgenin geri kazanım profili sırasıyla dört ve beş denklemlerine uyar. Geri kazanılan ağartılmış popülasyonun fraksiyonunu temsil eden lipit çift katmanının hareketli fraksiyonu 0.9'dan büyüktü ve bu da iyi bir lipit çift katmanını gösteriyordu. Myosin aktivitesi, kararlı durumda astro benzeri yapılara ortaya çıkan ve bağlı membran bileşeninin yerel kümelenmesini sağlayan kontraktil aktomiyozin akışlarını indükledi.
Herhangi bir fotoğraf hasarına neden olmadan etiketsiz aktomiyozin ağlarının dinamiklerini incelemek için interferometrik saçılma mikroskobu gibi çeşitli mikroskopi teknikleri kullanılabilir veya süper çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanılabilir. Bu teknik, membran protein komplekslerinin mimarilerini ve kompozisyonlarını modüle etmek için dinamik bir aktomiyozin ağı ile nasıl etkileşime girdiğini anlamak isteyen araştırmacıların yolunu açmaktadır.
