כאן אנו מדגימים הליך פשוט ופשוט יחסית להרכבת רשתות אקטומיוזין הקשורות לממברנה ולחקר הדינמיקה באמצעות טכניקות מיקרוסקופיות אור מתקדמות. היתרון העיקרי הוא שהבדיקה שלנו מאפשרת הוספה רציפה של חלבונים ומולקולות קטנות מבלי להפריע לרשתות הקשורות לממברנה. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לחקר חלבונים ציטוסקטליים אחרים או רשתות מרוכבות.
החלק הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא להבטיח שדו-שכבת השומנים הנתמכת נוצרת כראוי, ולכן ראשית, היינו צריכים לשלוט בשלב זה לפני שהתחלנו להוסיף את החלבונים הציטוסקטליים. כדי להתחיל, קח שלושה עד חמישה כיסויי זכוכית מלבניים והנח אותם בתוך צנצנת קופלין. הפעל את סוניק האמבטיה, והגדר את הטמפרטורה ל -65 מעלות צלזיוס.
מלאו את צנצנת הקופלין בתמיסת ניקוי 2% כדי לטבול את הכיסויים במלואם, והכניסו אותה לסוניק למשך 30 דקות במצב פולס מלא. השתמש במלקחיים מצופים PTFE קהים כדי להסיר את הכיסויים בזה אחר זה. שטפו אותם היטב במים מזוקקים, והניחו אותם בצנצנת קופלין אחרת מלאה בשני נתרן הידרוקסידי רגילים.
סונו את הכיסויים למשך 20 דקות במצב דופק מלא. מסירים את הכיסויים, שוטפים היטב במים מזוקקים ומניחים בצנצנת קופלין נוספת מלאה במים מזוקקים. לפני תחילת הניסוי, קחו את הצנצנת במכסה מנוע כימי המצויד באספקת גז חנקן.
השתמש בכפפות ומלקחיים כדי להסיר את הכיסויים כדי לייבש אותם מתחת לזרם החנקן. יבשו את שני הצדדים, והניחו אותם על רשת פלסטיק נקייה עם כיסוי. מניחים את הקופסה עם הכיסויים במייבש כדי למנוע מגע עם חלקיקי אבק, ואז לוקחים צינורות PCR אוטומטיים וחותכים את העפעפיים שלהם ואת החצאים החרוטיים התחתונים עם להב כירורגי חד.
קח את הצינורות הגליליים החתוכים למחצה, החל דבק הניתן לריפוי UV על השפה החלקה של כל צינור חתוך, והנח אותו הפוך על כיסוי שניקה זה עתה, כך שהשוליים יושבים שטוחים על הכיסוי. אין להזיז את הצילינדר לרוחב לאחר שהוא ממוקם על המכסה כדי להבטיח שהדבק לא יישפך לחלל המרכזי של התא. הניחו את כיסויי מיסב התא בתוך שואב אוזון UV עם אספקת חמצן ואקום.
הדליקו את אור ה-UV והאירו למשך שלוש עד חמש דקות כדי לאפשר לדבק להתפלמר. מוציאים את הכיסויים ובודקים אם יש דליפה בתאים, ומשליכים את התאים הדולפים. לשטוף כל תא עם חיץ היווצרות SLB, משאיר 100 microliters של חיץ בסוף.
מסמנים את רמת החיץ ב-100 מיקרוליטר עם סמן קבוע, לאחר מכן מוסיפים שני מיקרוליטרים של קלציום כלוריד טוחן 0.1 לתא, ואחריהם שמונה מיקרוליטרים של תמיסת ה-SUV לכל תא ודוגרים במשך 15 דקות ב-25 מעלות צלזיוס. הסר 50 microliters של חיץ היווצרות SLB, משאיר רק 50 microliters בתא הדגימה, ולאחר מכן להוסיף 100 microliters של XKMEH אחד לתא ומערבבים בעדינות. הסר 100 מיקרוליטר של החיץ מבלי לגעת בתחתית.
חזור על הכביסה שמונה עד 10 פעמים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של XKMEH אחד והסרת 100 מיקרוליטר. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר בטא-קזאין לדו-שכבתי, ערבבו בעדינות ודגרו במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו בטא-קזאין שלוש פעמים עם XKMEH אחד, והחזירו את רמת החיץ לרף של 100 מיקרוליטר.
במהלך הדגירה של בטא-קזאין, מוציאים אליקוט של חלבון מקשר ממברנה-אקטין למינוס 80 מעלות צלזיוס שהופשרה במהירות ב-37 מעלות צלזיוס, ואז שומרים אותו על קרח. לדלל את האליקוט עם מאגר דילול חלבונים לריכוז של מיקרומולר אחד. מוסיפים את חלבון המקשר לתמיסה בריכוז סופי מוגדר ומערבבים בעדינות.
יש לדגור במשך 30 עד 40 דקות בטמפרטורת החדר, ולשטוף שלוש עד חמש פעמים עם חיץ XKMEH אחד כדי להסיר את חלבון ה-HSE הלא מאוגד. החזירו את רמת החיץ בכל תא ל-100 מיקרוליטר. הדגימה מוכנה כעת להדמיה.
הפעל את המיקרוסקופ, את לייזרי העירור ואת מצלמות האיתור. ודא שהלייזר מיושר, שהמטרה מנקה והתוכנה מוכנה לרכישת תמונות. שים שמן על המטרה 100 פעמים, להרכיב את הדגימה על שלב המיקרוסקופ, ולמקד את המטרה על bilayer.
ודא שמיקום הלייזר הוא כזה שהוא עובר השתקפות פנימית מוחלטת על הדגימה. השתמש בעירור של 488 ננומטר. כדי לקבוע את שלמות הדו-שכבתי, בצע בדיקת FRAP מהירה על-ידי בחירת אזור עניין ב-bilayer והקלטת כמה תמונות של שדה הראייה באמצעות תנאי הדמיה המספקים יחס אות לרעש של חמישה לאחד ומעלה.
השהה את ההקלטה, וסגור את דיאפרגמת השדה של מיקרוסקופ TIRF כדי למקד קרן לייזר מרוכזת על אזור מעגלי קטן של הדו-שכבתי כדי להלבין באופן מקומי את הפלואורופורים. הפעל את הלייזר לתפוקה המרבית שלו כדי לצלם את האזור הקטן למשך שלוש עד 10 שניות, ולאחר מכן כבה את הלייזר. פתח מחדש את דיאפרגמת השדה לרדיוס המקורי שלה, התאם מחדש את מצב ההדמיה בחזרה להגדרות שלפני ההלבנה, ומיד חדש את הקלטת ההתאוששות של אות פלואורסצנטי בשדה הראייה.
בדקו אם הדו-שכבתי זורם, ושמרו את התמונות כקובצי TIF של 16 סיביות. ערבבו G-actin ללא תווית ועם תווית פלואורסצנטית ביחס טוחן אחד של 10 ל-10, והוסיפו לו G-buffer כך שריכוז ה-G-אקטין יהיה 20 מיקרומולר. הוסיפו עשירית ממאגר ME של פי 10 לתערובת לקבלת תמיסה חד-פעמית, ודגרו במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הפשיר בקבוקון של מכסה מלאי חלבון במהירות ב 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשמור אותו על קרח. יש לדלל באמצעות מאגרי G כך שריכוז חלבון המכסה כעת הוא כפול מהריכוז הסופי הרצוי, ולאחר מכן להוסיף נפח שווה של תמיסת חלבון המכסה המדוללת לתערובת האקטין. לבסוף, הוסיפו נפח שווה של חיץ מטרה טרי פי שניים לתערובת התגובה.
הנפח הסופי של הפתרון צריך להיות פי ארבעה מנפח תערובת האקטין. ודא שהריכוז הסופי של הרכיבים הוא כמתואר בכתב היד של הטקסט. דגירה של הדגימות בחושך ב-25 מעלות צלזיוס למשך 45 עד 60 דקות כדי לאפשר פילמור.
הוציאו בעדינות חמישה אקטין פולימריים מיקרומולריים עם קצה פיפטה קהה, והוסיפו אותו לצינור PCR נקי. הוסיפו XKMEH אחד לצינור כדי להפוך את הנפח הסופי ליותר מ-20 מיקרוליטרים, וערבבו בעדינות כדי למנוע גזירה של F-actin. מתא הדגימה המותקן, הסר נפח שווה של המאגר.
מוסיפים את תמיסת האקטין הפולימרית לתא, ומפטים בעדינות למעלה ולמטה שלוש פעמים מבלי לגעת בדו-שכבה בתחתית. הרכב את הדגימה על מיקרוסקופ TIRF, ותן לה לנוח במשך 20 עד 30 דקות. הקלט כמה תמונות משדות ראייה שונים לאחר שתוספת F-actin הגיעה למצב יציב.
לאחר 30 דקות של דגירה של אקטין, הרכיבו את הדגימה בחזרה על המיקרוסקופ. בדוק את האות על חלבון המקשר ותעלות F-actin. התאם את תנאי ההדמיה במידת הצורך.
בחר אזור טוב להקלטה בהילוך ארוך. הקלט 10 עד 15 פריימים ב-0.1 עד 0.2 הרץ לפני הוספת מיוזין, והשהה את ההקלטה. הוציאו את הנפח הנדרש של מיוזין שריר ממוחזר שניים מבקבוקון המלאי עם קצה פיפטה קהה, והוסיפו לצינור PCR נקי עם אוטוקלאב.
מיד להוסיף XKMEH אחד לצינור כדי להפוך את נפח יותר מ 20 microliters, ומערבבים בעדינות. הסר בזהירות נפח שווה של חיץ KMEH מתא הדגימה המותקן מבלי להפריע לו, והוסף בעדינות את תמיסת המיוזין לתא הדגימה. אין לקטר למעלה ולמטה, מכיוון שהוא יפריע לחוטים הקשורים לפני השטח.
חדש מיד את הקלטת קיטועי הזמן, ושמור את כל התמונות, ולאחר מכן צלם תמונות רקע עבור כל הערוצים באמצעות דגימת מאגר בלבד. שמור את כל התמונות כקבצי TIF. הערך המותאם של מקדם הדיפוזיה היה 1.34 מיקרומטר רבוע לשנייה, מה שהסכים מאוד עם הערך המחושב מבוסס הנוסחה של 1.39 מיקרומטר רבוע לשנייה.
פרופיל הקו לאחר ההלבנה ופרופיל ההתאוששות של האזור המולבן מתאימים למשוואות ארבע וחמש בהתאמה. החלק הנייד של דו-שכבת השומנים המייצג את החלק של האוכלוסייה הלבנה שמתאוששת בחזרה היה גדול מ-0.9, מה שמעיד על דו-שכבת שומנים טובה. פעילות מיוזין גרמה לזרימות אקטומיוזין מתכווצות שהגיחו למבנים דמויי אסטרו במצב יציב, מה שהניע אשכולות מקומיים של רכיב הממברנה המצומדת.
ניתן להשתמש במגוון טכניקות מיקרוסקופיה כגון מיקרוסקופיה של פיזור אינטרפרומטרי כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות אקטומיוזין ללא תווית מבלי לגרום נזק לתמונה, או להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים המעוניינים להבין כיצד קומפלקסים של חלבוני ממברנה מתקשרים עם רשת אקטומיוזין דינמית כדי לווסת את הארכיטקטורה וההרכב שלהם.
