Aqui, demonstramos um procedimento relativamente simples e direto para montar redes de actomiosina amarradas à membrana e estudar a dinâmica usando técnicas microscópicas de luz avançadas. A principal vantagem é que nosso ensaio permite a adição sequencial de proteínas e pequenas moléculas sem perturbar as redes ligadas à membrana. Este método pode ser facilmente adaptado para estudar outras proteínas citoesqueléticas ou redes compostas.
A parte mais crítica do protocolo é garantir que a bicamada lipídica suportada seja formada corretamente, então, primeiro, tivemos que dominar essa etapa antes de começar a adicionar as proteínas do citoesqueleto. Para começar, pegue de três a cinco tampas de vidro retangulares e coloque-as dentro de um frasco de coplin. Ligue o sonicator de banho e defina a temperatura para 65 graus Celsius.
Encha o frasco de coplin com uma solução de limpeza a 2% para submergir totalmente as tampas e coloque-o no sonicator durante 30 minutos em modo de pulso máximo. Use pinças revestidas de PTFE contundentes para remover as tampas uma a uma. Lave-os bem com água destilada e coloque-os em outro frasco de coplin cheio de dois hidróxidos de sódio normais.
Sonicate as tampas por 20 minutos no modo de pulso completo. Retire as tampas, enxágue bem com água destilada e coloque em outro frasco de coplin cheio de água destilada. Antes de iniciar o experimento, pegue o frasco em um exaustor químico equipado com um suprimento de gás nitrogênio.
Use luvas e pinças para remover as tampas para secá-las sob a corrente de nitrogênio. Seque ambos os lados e coloque-os em uma grade de plástico limpa com uma tampa. Coloque a caixa com as tampas em um exsicador para evitar o contato com partículas de poeira, em seguida, pegue tubos de PCR autoclavados e corte suas tampas e metades cônicas inferiores com uma lâmina cirúrgica afiada.
Pegue os tubos cilíndricos semicortados, aplique adesivo curável UV na borda lisa de cada tubo de corte e coloque-o invertido em uma tampa recém-limpa, de modo que o aro fique plano no deslizamento da tampa. Não mova o cilindro lateralmente depois de posicionado na tampa para garantir que a cola não se derrame no espaço central da câmara. Coloque as tampas do rolamento da câmara dentro de um limpador de ozônio UV com um suprimento de oxigênio e aspirador.
Ligue a luz UV e acenda por três a cinco minutos para permitir que o adesivo polimerize. Retire as tampas e teste as câmaras quanto a vazamentos e descarte as câmaras com vazamento. Lave cada câmara com tampão de formação SLB, deixando 100 microlitros de tampão no final.
Marque o nível do tampão em 100 microlitros com um marcador permanente, em seguida, adicione dois microlitros de cloreto de cálcio molar 0,1 à câmara, seguido por oito microlitros da solução SUV a cada câmara e incube por 15 minutos a 25 graus Celsius. Remova 50 microlitros do tampão de formação SLB, deixando apenas 50 microlitros na câmara de amostra, em seguida, adicione 100 microlitros de um XKMEH à câmara e misture suavemente. Remova 100 microlitros do buffer sem tocar no fundo.
Repita as lavagens oito a 10 vezes, adicionando 100 microlitros de um XKMEH e removendo 100 microlitros. Adicione 10 microlitros de um miligrama por mililitro de beta-caseína à bicamada, misture suavemente e incube por cinco a 10 minutos à temperatura ambiente. Lave a beta-caseína três vezes com um XKMEH e traga o nível do tampão de volta à marca de 100 microlitros.
Durante a incubação da beta-caseína, retire uma alíquota da proteína ligadora membrana-actina por menos 80 graus Celsius descongelada rapidamente a 37 graus Celsius e, em seguida, mantenha-a no gelo. Diluir a alíquota com tampão de diluição proteica até uma concentração de um micromolar. Adicionar a proteína ligadora à solução a uma concentração final definida e misturar suavemente.
Incubar durante 30 a 40 minutos à temperatura ambiente e lavar três a cinco vezes com um tampão XKMEH para remover a proteína HSE não ligada. Traga o nível de buffer em cada câmara de volta para a marca de 100 microlitros. A amostra agora está pronta para geração de imagens.
Ligue o microscópio, os lasers de excitação e as câmeras de detecção. Certifique-se de que o laser esteja alinhado, a objetiva esteja limpa e o software esteja pronto para adquirir imagens. Coloque o óleo na objetiva 100 vezes, monte a amostra no estágio do microscópio e concentre a objetiva na bicamada.
Certifique-se de que a posição do laser seja tal que sofra uma reflexão interna total na amostra. Use uma excitação de 488 nanômetros. Para determinar a integridade da bicamada, execute um ensaio rápido de FRAP selecionando uma região de interesse na bicamada e gravando algumas imagens do campo de visão usando condições de imagem que forneçam uma relação sinal-ruído de cinco para um ou superior.
Pause a gravação e feche o diafragma de campo do microscópio TIRF para focar um feixe de laser concentrado em uma pequena região circular da bicamada para branquear localmente os fluoróforos. Ligue o laser até sua saída máxima para branquear a pequena região por três a 10 segundos e, em seguida, desligue o laser. Reabra o diafragma de campo ao seu raio original, reajuste a condição de imagem de volta às configurações pré-alvejante e retome imediatamente a gravação da recuperação do sinal fluorescente no campo de visão.
Verifique se a bicamada é fluida e salve as imagens como arquivos TIF de 16 bits de pontos. Misture a G-actina não marcada e fluorescentemente marcada em uma proporção molar de 10 para um e complemente-a com G-buffer para que a concentração de G-actina seja de 20 micromolares. Adicione um décimo de 10 vezes o tampão ME à mistura para uma solução única e incube por dois minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, descongele o frasco para injetáveis de proteína de tampa rapidamente a 37 graus Celsius e, em seguida, mantenha-o no gelo. Diluir com tamponamentos G de tal forma que a concentração de proteína de cobertura seja agora o dobro da concentração final desejada e, em seguida, adicionar um volume igual da solução de proteína de cobertura diluída à mistura de actina. Finalmente, adicione um volume igual de tampão fresco de duas vezes alvo à mistura de reação.
O volume final da solução deve ser quatro vezes o volume da mistura de actina. Certifique-se de que a concentração final de componentes seja a descrita no manuscrito do texto. Incubar as amostras no escuro a 25 graus Celsius por 45 a 60 minutos para permitir a polimerização.
Pipete suavemente cinco actina micromolar polimerizada com uma ponta de pipeta de extremidade romba e adicione-a a um tubo de PCR autoclavado limpo. Adicione um XKMEH ao tubo para tornar o volume final superior a 20 microlitros e misture suavemente para evitar o cisalhamento da actina F. Da câmara de amostra montada, remova um volume igual do buffer.
Adicione a solução de actina polimerizada à câmara e pipete suavemente para cima e para baixo três vezes sem tocar na bicamada no fundo. Monte a amostra no microscópio TIRF e deixe descansar por 20 a 30 minutos. Grave algumas imagens de diferentes campos de visão após a adição de actina F ter atingido um estado estacionário.
Após 30 minutos de incubação da actina, monte a amostra de volta ao microscópio. Verifique o sinal na proteína ligadora e nos canais de actina F. Ajuste as condições de imagem, se necessário.
Selecione uma boa região para uma gravação de longo lapso de tempo. Grave de 10 a 15 quadros a 0,1 a 0,2 hertz antes da adição de miosina e pause a gravação. Pipetar o volume necessário de miosina muscular reciclada dois do frasco para injetáveis de estoque com uma ponta de pipeta de extremidade romba e adicionar a um tubo de PCR autoclavado limpo.
Adicione imediatamente um XKMEH ao tubo para tornar o volume superior a 20 microlitros e misture suavemente. Remova cuidadosamente um volume igual do tampão KMEH da câmara de amostra montada sem perturbá-la e adicione suavemente a solução de miosina à câmara de amostra. Não pipete para cima e para baixo, pois isso perturbará os filamentos ligados à superfície.
Retome imediatamente a gravação de lapso de tempo e salve todas as imagens e, em seguida, tire imagens de fundo para todos os canais usando apenas uma amostra de buffer. Salve todas as imagens como arquivos TIF. O valor ajustado do coeficiente de difusão foi de 1,34 micrômetros quadrados por segundo, o que concordou estreitamente com o valor calculado baseado em fórmula de 1,39 micrômetros quadrados por segundo.
O perfil da linha após o fotobranqueamento e o perfil de recuperação da região branqueada se ajustam às equações quatro e cinco, respectivamente. A fração móvel da bicamada lipídica representando a fração da população branqueada que se recupera foi maior que 0,9, indicando uma boa bicamada lipídica. A atividade da miosina induziu fluxos contráteis de actomiosina que emergiram em estruturas astro-like no estado estacionário, conduzindo o agrupamento local do componente da membrana acoplada.
Pode-se usar uma variedade de técnicas de microscopia, como a microscopia de espalhamento interferométrico para estudar a dinâmica de redes de actomiosina não marcadas sem induzir qualquer dano fotográfico, ou usar microscopia de fluorescência de super resolução. Esta técnica abre o caminho para os pesquisadores interessados em entender como os complexos proteicos de membrana interagem com uma rede dinâmica de actomiosina para modular sua arquitetura e composição.
