여기에서는 멤브레인 연결 액토미오신 네트워크를 조립하고 고급 광학 현미경 기술을 사용하여 역학을 연구하는 비교적 간단하고 간단한 절차를 보여줍니다. 주요 이점은 당사의 분석이 멤브레인 연결 네트워크를 방해하지 않고 단백질과 소분자를 순차적으로 첨가할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 다른 세포 골격 단백질 또는 복합 네트워크를 연구하는 데 쉽게 적용 할 수 있습니다.
프로토콜의 가장 중요한 부분은 지원되는 지질 이중층이 올바르게 형성되었는지 확인하는 것이므로 먼저 세포골격 단백질을 추가하기 전에 이 단계를 마스터해야 했습니다. 시작하려면 3-5 개의 직사각형 유리 커버 슬립을 가져 와서 코플린 병 안에 넣으십시오. 목욕 초음파 처리기를 켜고 온도를 섭씨 65도로 설정합니다.
코플린 병에 2% 세척 용액을 채워 커버슬립을 완전히 담그고 전체 펄스 모드에서 30분 동안 초음파 처리기에 넣습니다. 무딘 PTFE 코팅 집게를 사용하여 커버 슬립을 하나씩 제거하십시오. 증류수로 철저히 헹구고 두 개의 일반 수산화 나트륨으로 채워진 다른 코플린 병에 넣으십시오.
전체 펄스 모드에서 20분 동안 커버슬립을 초음파 처리합니다. 커버 슬립을 제거하고 증류수로 철저히 헹구고 증류수가 채워진 다른 코플린 병에 넣으십시오. 실험을 시작하기 전에 질소 가스 공급 장치가 장착 된 화학 후드에 항아리를 가져 가십시오.
장갑과 집게를 사용하여 커버 슬립을 제거하여 질소 흐름 아래에서 건조시킵니다. 양면을 말리고 덮개가있는 깨끗한 플라스틱 격자 위에 놓습니다. 먼지 입자와의 접촉을 피하기 위해 커버슬립이 있는 상자를 데시케이터에 넣은 다음 오토클레이브 PCR 튜브를 가져와 날카로운 수술용 칼날로 뚜껑과 아래쪽 원추형 반쪽을 잘라냅니다.
원통형 하프 컷 튜브를 잡고 각 절단 튜브의 매끄러운 림에 UV 경화 접착제를 바르고 림이 커버 슬립에 평평하게 놓이도록 새로 청소 한 커버 슬립에 거꾸로 놓습니다. 접착제가 챔버의 중앙 공간으로 흘러 들어가지 않도록 실린더가 커버슬립에 위치하면 실린더를 옆으로 움직이지 마십시오. 챔버 베어링 커버슬립을 산소 공급 및 진공 청소기가 있는 UV 오존 클리너 안에 넣습니다.
UV 광선을 켜고 접착제가 중합되도록 3-5분 동안 조명합니다. 커버슬립을 꺼내 챔버의 누출 여부를 테스트하고 새는 챔버는 폐기합니다. SLB 형성 완충액으로 각 챔버를 세척하고 끝에 100 마이크로 리터의 완충액을 남깁니다.
영구 마커로 완충액의 수준을 100 마이크로 리터로 표시 한 다음 챔버에 0.1 몰 염화칼슘 2 마이크로 리터를 추가 한 다음 각 챔버에 8 마이크로 리터의 SUV 용액을 넣고 섭씨 25도에서 15 분 동안 배양합니다. 50 마이크로 리터의 SLB 형성 버퍼를 제거하고 샘플 챔버에 50 마이크로 리터 만 남겨 둔 다음 100 마이크로 리터의 XKMEH를 챔버에 추가하고 부드럽게 혼합합니다. 바닥에 닿지 않고 100 마이크로 리터의 버퍼를 제거하십시오.
100 마이크로 리터의 XKMEH를 추가하고 100 마이크로 리터를 제거하여 세척을 8-10 회 반복하십시오. 10 마이크로 리터의 밀리리터 베타 카제인 당 1 밀리그램을 이중층에 넣고 부드럽게 섞은 다음 실온에서 5-10 분 동안 배양합니다. 하나의 XKMEH로 베타 카제인을 세 번 씻어 내고 완충액 수준을 100 마이크로 리터 표시로 되돌립니다.
베타 카제인 배양 중에 섭씨 영하 80도에서 37도에서 빠르게 해동 된 멤브레인 액틴 링커 단백질의 분취액을 꺼내 얼음 위에 보관하십시오. 분취량을 단백질 희석 완충액으로 1 마이크로몰 농도로 희석한다. 링커 단백질을 정의된 최종 농도로 용액에 첨가하고 부드럽게 혼합합니다.
실온에서 30 내지 40분 동안 배양하고, 하나의 XKMEH 완충액으로 3 내지 5회 세척하여 결합되지 않은 HSE 단백질을 제거하였다. 각 챔버의 완충액 수준을 100 마이크로 리터 표시로 되돌립니다. 이제 샘플을 이미징할 준비가 되었습니다.
현미경, 여기 레이저 및 감지 카메라를 켭니다. 레이저가 정렬되고 대물렌즈가 청소되었으며 소프트웨어가 이미지를 획득할 준비가 되었는지 확인합니다. 100배 대물렌즈에 오일을 바르고 샘플을 현미경 스테이지에 장착하고 대물렌즈를 이중층에 초점을 맞춥니다.
레이저 위치가 샘플에 대한 전체 내부 반사를 받도록 하십시오. 488 나노 미터 여기를 사용하십시오. 이중층의 무결성을 결정하려면 이중층에서 관심 영역을 선택하고 5 대 1 이상의 신호 대 잡음비를 제공하는 이미징 조건을 사용하여 시야의 몇 가지 이미지를 기록하여 빠른 FRAP 분석을 수행합니다.
기록을 일시 중지하고 TIRF 현미경의 필드 다이어프램을 닫아 이중층의 작은 원형 영역에 집중된 레이저 빔을 집중시켜 형광단을 국부적으로 표백합니다. 레이저를 최대 출력으로 켜서 작은 영역을 3-10 초 동안 포토 블리치 한 다음 레이저를 끕니다. 필드 다이어프램을 원래 반경으로 다시 열고 이미징 조건을 사전 표백제 설정으로 다시 조정한 다음 즉시 시야에서 형광 신호 복구 기록을 다시 시작합니다.
이중층이 유동적인지 확인하고 이미지를 16비트 도트 TIF 파일로 저장합니다. 표지되지 않은 G- 액틴과 형광 표지 된 G- 액틴을 10 대 1 몰비로 혼합하고 G- 액틴의 농도가 20 마이크로 몰이되도록 G- 버퍼로 채 웁니다. 1회 용액에 대해 ME 완충액 10분의 1을 혼합물에 첨가하고, 실온에서 2분 동안 배양한다.
다음으로, 캡핑 단백질 스톡의 바이알을 섭씨 37도에서 빠르게 해동한 다음 얼음 위에 보관합니다. 캡핑 단백질의 농도가 이제 원하는 최종 농도의 두 배가 되도록 G-완충액으로 희석한 다음 동일한 부피의 희석된 캡핑 단백질 용액을 액틴 혼합물에 추가합니다. 마지막으로, 동일한 부피의 신선한 2배 표적 완충액을 반응 혼합물에 첨가한다.
용액의 최종 부피는 액틴 혼합물의 부피의 4 배가되어야합니다. 구성 요소의 최종 농도가 텍스트 원고에 설명된 대로인지 확인하십시오. 중합을 허용하기 위해 섭씨 25도의 어두운 곳에서 45 내지 60분 동안 샘플을 인큐베이션한다.
끝이 뭉툭한 피펫 팁으로 5개의 마이크로몰 중합 액틴을 부드럽게 피펫팅하고 깨끗한 오토클레이브 PCR 튜브에 추가합니다. 튜브에 XKMEH 하나를 추가하여 최종 부피를 20 마이크로 리터 이상으로 만들고 F- 액틴을 전단하지 않도록 부드럽게 혼합하십시오. 장착된 샘플 챔버에서 동일한 부피의 버퍼를 제거합니다.
중합 된 액틴 용액을 챔버에 넣고 바닥의 이중층을 건드리지 않고 부드럽게 위아래로 세 번 피펫팅합니다. 샘플을 TIRF 현미경에 장착하고 20-30분 동안 그대로 두십시오. F-actin 첨가가 정상 상태에 도달한 후 다른 시야에서 몇 개의 이미지를 기록합니다.
액틴 배양 30분 후 샘플을 현미경에 다시 장착합니다. 링커 단백질과 F- 액틴 채널의 신호를 확인하십시오. 필요한 경우 이미징 조건을 조정합니다.
긴 타임랩스 녹화에 적합한 영역을 선택합니다. 미오신 첨가 전에 0.1 - 0.2 헤르츠에서 10 내지 15 프레임을 기록하고 녹화를 일시 정지한다. 뭉툭한 피펫 팁으로 스톡 바이알에서 필요한 양의 재생 근육 미오신 2개를 피펫팅하고 깨끗한 오토클레이브 PCR 튜브에 추가합니다.
즉시 하나의 XKMEH를 튜브에 추가하여 부피를 20 마이크로 리터 이상으로 만들고 부드럽게 혼합하십시오. 장착 된 샘플 챔버에서 동일한 부피의 KMEH 버퍼를 방해하지 않고 조심스럽게 제거하고 미오신 용액을 샘플 챔버에 부드럽게 추가합니다. 피펫팅은 표면 결합 필라멘트를 방해하므로 위아래로 피펫팅하지 마십시오.
즉시 타임랩스 녹화를 다시 시작하고 모든 이미지를 저장한 다음 버퍼 전용 샘플을 사용하여 모든 채널의 배경 이미지를 촬영합니다. 모든 이미지를 TIF 파일로 저장합니다. 확산 계수의 적합치는 초당 1.34 평방 마이크로 미터였으며, 이는 초당 1.39 평방 마이크로 미터의 공식 기반 계산 값과 거의 일치했습니다.
광퇴색 후의 선 프로파일과 표백 영역의 회복 프로파일은 각각 방정식 4 및 5에 적합하다. 표백된 개체군이 다시 회복되는 분율을 나타내는 지질 이중층의 이동 분율은 0.9보다 컸으며, 이는 양호한 지질 이중층을 나타냅니다. 미오신 활동은 정상 상태에서 아스트로와 유사한 구조로 출현하는 수축성 액토미오신 흐름을 유도하여 결합된 막 구성 요소의 국소 클러스터링을 유도했습니다.
간섭계 산란 현미경과 같은 다양한 현미경 기술을 사용하여 광 손상을 유발하지 않고 라벨링되지 않은 액토미오신 네트워크의 역학을 연구하거나 초고해상도 형광 현미경을 사용할 수 있습니다. 이 기술은 막 단백질 복합체가 동적 액토미오신 네트워크와 상호 작용하여 구조와 구성을 조절하는 방법을 이해하는 데 관심이 있는 연구자들에게 길을 열어줍니다.
