Здесь мы демонстрируем относительно простую и понятную процедуру сборки мембранно-привязанных сетей актомиозина и изучения динамики с использованием передовых световых микроскопических методов. Ключевым преимуществом является то, что наш анализ позволяет последовательно добавлять белки и небольшие молекулы, не нарушая мембранно-привязанные сети. Этот метод может быть легко адаптирован для изучения других цитоскелетных белков или композитных сетей.
Наиболее важной частью протокола является обеспечение правильного формирования поддерживаемого липидного бислоя, поэтому сначала мы должны были освоить этот шаг, прежде чем начать добавлять цитоскелетные белки. Для начала возьмите от трех до пяти прямоугольных стеклянных крышек и поместите их в банку с коплином. Включите сонистатор для ванны и установите температуру на 65 градусов цельсия.
Наполните банку коплина 2% чистящим раствором, чтобы полностью погрузить крышки, и поместите ее в ультразвуковой аппарат на 30 минут в режиме полного импульса. Используйте тупые щипцы с покрытием из PTFE, чтобы удалить обшивки один за другим. Тщательно промойте их дистиллированной водой и поместите в другую банку коплина, наполненную двумя нормальными гидроксидами натрия.
Обжаривайте крышки ультразвуком в течение 20 минут в режиме полного импульса. Снимите крышки, тщательно промойте дистиллированной водой и поместите в другую банку коплина, наполненную дистиллированной водой. Перед началом эксперимента возьмите банку в химическую вытяжку, оснащенную газообразным азотом.
Используйте перчатки и щипцы, чтобы снять крышки, чтобы высушить их под потоком азота. Высушите обе стороны, и поместите их на чистую пластиковую сетку с крышкой. Поместите коробку с крышками в осушитель, чтобы избежать контакта с частицами пыли, затем возьмите автоклавные трубки ПЦР и вырежьте их крышки и нижние конические половинки острым хирургическим лезвием.
Возьмите цилиндрические полуразрезные трубки, нанесите УФ-отверждаемый клей на гладкий обод каждой разрезанной трубки и поместите его перевернутым на свежеочищенную крышку так, чтобы ободок сидел ровно на крышке. Не перемещайте цилиндр в боковом направлении, как только он расположен на крышке, чтобы клей не пролился в центральное пространство камеры. Поместите крышки подшипников камеры внутрь УФ-озоноочистителя с подачей кислорода и пылесосом.
Включите ультрафиолетовый свет и зажгите в течение трех-пяти минут, чтобы клей полимеризовался. Выньте крышки и проверьте камеры на герметичность, а также выбросьте протекающие камеры. Промывайте каждую камеру буфером формирования SLB, оставляя 100 микролитров буфера на конце.
Отметьте уровень буфера в 100 микролитров постоянным маркером, затем добавьте в камеру два микролитра 0,1 молярного хлорида кальция, затем восемь микролитров раствора внедорожника в каждую камеру и инкубируйте в течение 15 минут при 25 градусах Цельсия. Удалите 50 микролитров буфера формирования SLB, оставив только 50 микролитров в камере для образцов, затем добавьте 100 микролитров одного XKMEH в камеру и аккуратно перемешайте. Удалите 100 микролитров буфера, не касаясь дна.
Повторите промывку от восьми до 10 раз, добавив 100 микролитров одного XKMEH и удалив 100 микролитров. Добавьте 10 микролитров одного миллиграмма на миллилитр бета-казеина в бислой, аккуратно перемешайте и высиживайте в течение пяти-10 минут при комнатной температуре. Трижды смойте бета-казеин одним XKMEH и верните уровень буфера к отметке 100 микролитров.
Во время инкубации бета-казеина вынимают аликвоту мембранно-актинового белка-линкера за минус 80 градусов Цельсия, быстро оттаивающего при 37 градусах Цельсия, а затем держат его на льду. Разбавить аликвоту буфером разбавления белка до концентрации одного микромоляра. Добавьте линкерный белок в раствор в определенной конечной концентрации и аккуратно перемешайте.
Инкубировать в течение 30-40 минут при комнатной температуре и промыть три-пять раз одним буфером XKMEH, чтобы удалить несвязанный белок HSE. Доведите уровень буфера в каждой камере до отметки 100 микролитров. Теперь образец готов к визуализации.
Включите микроскоп, лазеры возбуждения и камеры обнаружения. Убедитесь, что лазер выровнен, объектив очищен, а программное обеспечение готово к получению изображений. Нанесите масло на объектив в 100 раз, установите образец на ступень микроскопа и сфокусируйте цель на бислое.
Убедитесь, что положение лазера таково, что он подвергается полному внутреннему отражению на образце. Используйте 488-нанометровое возбуждение. Чтобы определить целостность бислоя, выполните быстрый анализ FRAP, выбрав интересующую область на бислое и записав несколько изображений поля зрения с использованием условий визуализации, которые обеспечивают отношение сигнал/шум от пяти к одному или выше.
Приостановите запись и закройте полевую диафрагму микроскопа TIRF, чтобы сфокусировать концентрированный лазерный луч на небольшой круговой области бислоя, чтобы локально отбелить флуорофоры. Включите лазер до максимальной мощности, чтобы отбеливать небольшую область в течение трех-10 секунд, а затем выключите лазер. Снова откройте полевую диафрагму до ее первоначального радиуса, перенастройте состояние изображения обратно на настройки до отбеливания и немедленно возобновите запись восстановления флуоресцентного сигнала в поле зрения.
Проверьте, является ли бислой текучим, и сохраните изображения в виде 16-битных точечных файлов TIF. Смешайте немаркированный и флуоресцентно меченый G-актин в молярном соотношении 10 к одному и доливайте его G-буфером так, чтобы концентрация G-актина составляла 20 микромоляров. Добавьте одну десятую часть 10-кратного ME-буфера в смесь для одноразового раствора и инкубируйте в течение двух минут при комнатной температуре.
Далее разморозьте флакон с укупорочным белковым запасом быстро при 37 градусах Цельсия, а затем держите его на льду. Разбавить G-буферами таким образом, чтобы концентрация укупорочного белка теперь в два раза превышала его желаемую конечную концентрацию, затем добавить равный объем разбавленного раствора укупорочного белка в смесь актина. Наконец, добавьте в реакционную смесь равный объем свежего двухкратного целевого буфера.
Конечный объем раствора должен в четыре раза превышать объем актиновой смеси. Убедитесь, что конечная концентрация компонентов соответствует описанию в тексте рукописи. Инкубируйте образцы в темноте при 25 градусах Цельсия в течение 45-60 минут, чтобы обеспечить полимеризацию.
Аккуратно выделите пять микромоляльных полимеризованных актинов с тупым концом пипетки и добавьте его в чистую автоклавную ПЦР-трубку. Добавьте один XKMEH в трубку, чтобы сделать конечный объем более 20 микролитров, и аккуратно перемешайте, чтобы избежать сдвига F-актина. Из установленной камеры для отбора проб извлеките равный объем буфера.
Добавьте полимеризованный раствор актина в камеру и аккуратно трижды пипеткой вверх и вниз, не касаясь бислоя внизу. Установите образец на микроскоп TIRF и дайте ему отдохнуть в течение 20-30 минут. Запишите несколько изображений из разных полей зрения после того, как добавление F-актина достигло устойчивого состояния.
После 30 минут инкубации актина установите образец обратно на микроскоп. Проверьте сигнал на линкерных белковых и F-актиновых каналах. При необходимости отрегулируйте условия визуализации.
Выберите подходящую область для длительной покадровой записи. Запишите от 10 до 15 кадров со скоростью от 0,1 до 0,2 герца перед добавлением миозина и приостановите запись. Выделите необходимый объем переработанного мышечного миозина двумя из флакона с тупым концом пипетки и добавьте в чистую автоклавную ПЦР-трубку.
Сразу же добавьте один XKMEH в трубку, чтобы объем составил более 20 микролитров, и аккуратно перемешайте. Осторожно извлеките равный объем буфера KMEH из установленной камеры для отбора проб, не нарушая его, и осторожно добавьте раствор миозина в камеру для отбора проб. Не пипетку вверх и вниз, так как это потревожит связанные с поверхностью нити.
Немедленно возобновите покадровую запись и сохраните все изображения, а затем сделайте фоновые изображения для всех каналов, используя только буферный образец. Сохраните все изображения в виде файлов TIF. Установленное значение коэффициента диффузии составляло 1,34 квадратных микрометра в секунду, что близко соответствовало расчетному значению на основе формулы в 1,39 квадратных микрометра в секунду.
Профиль линии после фотоотбеливания и профиль восстановления обесцвеченной области соответствуют уравнениям четыре и пять соответственно. Подвижная фракция липидного бислоя, представляющего собой долю обесцвеченной популяции, которая восстанавливается обратно, была больше 0,9, что указывает на хороший липидный бислой. Активность миозина индуцировала сократительные потоки актомиозина, которые возникли в астроподобные структуры в устойчивом состоянии, управляя локальной кластеризацией связанного мембранного компонента.
Можно использовать различные методы микроскопии, такие как интерферометрическая рассеивающая микроскопия, для изучения динамики немаркированных сетей актомиозина, не вызывая каких-либо повреждений фотографий, или использовать флуоресцентную микроскопию со сверхвысоким разрешением. Этот метод прокладывает путь для исследователей, заинтересованных в понимании того, как мембранные белковые комплексы взаимодействуют с динамической сетью актомиозина для модуляции их архитектуры и состава.
