Qui, dimostriamo una procedura relativamente semplice e diretta per assemblare reti di actomiosina legate alla membrana e studiare la dinamica utilizzando tecniche microscopiche avanzate di luce. Il vantaggio principale è che il nostro test consente l'aggiunta sequenziale di proteine e piccole molecole senza disturbare le reti legate alla membrana. Questo metodo può essere facilmente adattato per studiare altre proteine citoscheletriche o reti composite.
La parte più critica del protocollo è garantire che il doppio strato lipidico supportato sia formato correttamente, quindi prima abbiamo dovuto padroneggiare questo passaggio prima di iniziare ad aggiungere le proteine citoscheletriche. Per iniziare, prendi da tre a cinque coprivetrini rettangolari e mettili all'interno di un barattolo di coplin. Accendere il sonicatore del bagno e impostare la temperatura su 65 gradi Celsius.
Riempire il barattolo di coplin con una soluzione detergente al 2% per immergere completamente i vetrini di copertura e posizionarlo nel sonicatore per 30 minuti in modalità full pulse. Utilizzare una pinza smussata con rivestimento in PTFE per rimuovere i coperchi uno per uno. Risciacquarli accuratamente con acqua distillata e metterli in un altro barattolo di coplin riempito con due normali idrossido di sodio.
Sonica i coperchi per 20 minuti in modalità full pulse. Rimuovere i coperchi, sciacquare abbondantemente con acqua distillata e metterli in un altro barattolo di coplin pieno di acqua distillata. Prima di iniziare l'esperimento, prendi il barattolo in una cappa chimica dotata di una fornitura di gas azoto.
Utilizzare guanti e pinze per rimuovere i coprivetrini per asciugarli sotto il flusso di azoto. Asciugare entrambi i lati e posizionarli su una griglia di plastica pulita con un coperchio. Posizionare la scatola con i vetrini di copertura in un essiccatore per evitare il contatto con particelle di polvere, quindi prendere tubi PCR autoclavati e tagliare i coperchi e le metà coniche inferiori con una lama chirurgica affilata.
Prendi i tubi cilindrici tagliati a metà, applica l'adesivo polimerizzabile UV sul bordo liscio di ciascun tubo tagliato e posizionalo invertito su un coprivetrino appena pulito in modo che il bordo si trovi piatto sul coprivetrino. Non spostare il cilindro lateralmente una volta posizionato sul vetrino di copertura per assicurarsi che la colla non si riversi nello spazio centrale della camera. Inserire i coperchi dei cuscinetti della camera all'interno di un detergente ad ozono UV con un apporto di ossigeno e vuoto.
Accendere la luce UV e illuminare per tre-cinque minuti per consentire all'adesivo di polimerizzare. Estrarre i vetrini di copertura e testare le camere per le perdite, quindi scartare le camere che perdono. Lavare ogni camera con tampone di formazione SLB, lasciando 100 microlitri di tampone all'estremità.
Segnare il livello del tampone a 100 microlitri con un pennarello permanente, quindi aggiungere due microlitri di cloruro di calcio molare 0,1 alla camera, seguiti da otto microlitri della soluzione SUV in ciascuna camera e incubare per 15 minuti a 25 gradi Celsius. Rimuovere 50 microlitri del tampone di formazione SLB, lasciando solo 50 microlitri nella camera del campione, quindi aggiungere 100 microlitri di un XKMEH alla camera e mescolare delicatamente. Rimuovere 100 microlitri del tampone senza toccare il fondo.
Ripetere i lavaggi da otto a 10 volte aggiungendo 100 microlitri di un XKMEH e rimuovendo 100 microlitri. Aggiungere 10 microlitri di un milligrammo per millilitro di beta-caseina al doppio strato, mescolare delicatamente e incubare per cinque a 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare via la beta-caseina tre volte con un XKMEH e riportare il livello del tampone al segno di 100 microlitri.
Durante l'incubazione della beta-caseina, estrarre un'aliquota della proteina linker membrana-actina per meno 80 gradi Celsius scongelata rapidamente a 37 gradi Celsius, quindi tenerla sul ghiaccio. Diluire l'aliquota con tampone di diluizione proteica fino ad una concentrazione di un micromolare. Aggiungere la proteina linker alla soluzione ad una concentrazione finale definita e mescolare delicatamente.
Incubare per 30-40 minuti a temperatura ambiente e lavare da tre a cinque volte con un tampone XKMEH per rimuovere la proteina HSE non legata. Riportare il livello del tampone in ogni camera al segno di 100 microlitri. Il campione è ora pronto per l'imaging.
Accendi il microscopio, i laser di eccitazione e le telecamere di rilevamento. Assicurati che il laser sia allineato, che l'obiettivo sia pulito e che il software sia pronto per acquisire immagini. Mettere l'olio sull'obiettivo 100 volte, montare il campione sul palco del microscopio e focalizzare l'obiettivo sul doppio strato.
Assicurarsi che la posizione del laser sia tale da subire una riflessione interna totale sul campione. Utilizzare un'eccitazione a 488 nanometri. Per determinare l'integrità del doppio strato, eseguire un rapido test FRAP selezionando una regione di interesse sul bistrato e registrando alcune immagini del campo visivo utilizzando condizioni di imaging che forniscono un rapporto segnale/rumore di cinque a uno o superiore.
Mettere in pausa la registrazione e chiudere il diaframma di campo del microscopio TIRF per focalizzare un raggio laser concentrato su una piccola regione circolare del doppio strato per sbiancare localmente i fluorofori. Accendere il laser alla sua massima potenza per fotosbiancare la piccola regione da tre a 10 secondi, quindi spegnere il laser. Riaprire il diaframma di campo al suo raggio originale, regolare nuovamente le condizioni di imaging alle impostazioni pre-candeggina e riprendere immediatamente la registrazione del recupero del segnale fluorescente nel campo visivo.
Controlla se il bilayer è fluido e salva le immagini come file TIF a 16 bit. Mescolare G-actina non etichettata e marcata con fluorescenza in un rapporto molare di 10 a uno e rabboccare con G-buffer in modo che la concentrazione di G-actina sia di 20 micromolari. Aggiungere un decimo di 10 volte il tampone ME alla miscela per una soluzione una tantum e incubare per due minuti a temperatura ambiente.
Quindi, scongelare rapidamente la fiala di tappatura delle scorte proteiche a 37 gradi Celsius, quindi tenerla in ghiaccio. Diluire con G-buffer in modo tale che la concentrazione della proteina di tappatura sia ora il doppio della concentrazione finale desiderata, quindi aggiungere un volume uguale della soluzione proteica di copertura diluita alla miscela di actina. Infine, aggiungere un volume uguale di tampone target fresco due volte al mix di reazione.
Il volume finale della soluzione dovrebbe essere quattro volte il volume della miscela di actina. Assicurarsi che la concentrazione finale dei componenti sia quella descritta nel manoscritto testuale. Incubare i campioni al buio a 25 gradi Celsius per 45-60 minuti per consentire la polimerizzazione.
Pipettare delicatamente cinque actina polimerizzata micromolare con una punta di pipetta smussata e aggiungerla a un tubo PCR autoclavato pulito. Aggiungere un XKMEH al tubo per rendere il volume finale più di 20 microlitri e mescolare delicatamente per evitare di tagliare F-actina. Dalla camera di campionamento montata, rimuovere un volume uguale del buffer.
Aggiungere la soluzione polimerizzata di actina alla camera e pipettare delicatamente su e giù tre volte senza toccare il doppio strato sul fondo. Montare il campione sul microscopio TIRF e lasciarlo riposare per 20-30 minuti. Registra alcune immagini da diversi campi visivi dopo che l'aggiunta di F-actin ha raggiunto uno stato stazionario.
Dopo 30 minuti di incubazione dell'actina, montare nuovamente il campione sul microscopio. Controllare il segnale sulla proteina linker e sui canali F-actina. Regolare le condizioni di imaging, se necessario.
Seleziona una buona regione per una registrazione time-lapse lunga. Registra da 10 a 15 fotogrammi da 0,1 a 0,2 hertz prima dell'aggiunta di miosina e metti in pausa la registrazione. Pipettare il volume richiesto di miosina muscolare riciclata due dal flaconcino di riserva con una punta di pipetta smussata e aggiungere a un tubo PCR autoclavato pulito.
Aggiungere immediatamente un XKMEH al tubo per rendere il volume più di 20 microlitri e mescolare delicatamente. Rimuovere con cautela un volume uguale del tampone KMEH dalla camera del campione montata senza disturbarlo e aggiungere delicatamente la soluzione di miosina alla camera del campione. Non pipettare su e giù, poiché disturberebbe i filamenti legati alla superficie.
Riprendi immediatamente la registrazione time-lapse e salva tutte le immagini, quindi scatta immagini di sfondo per tutti i canali utilizzando un campione solo buffer. Salva tutte le immagini come file TIF. Il valore adattato del coefficiente di diffusione era di 1,34 micrometri quadrati al secondo, che concordava strettamente con il valore calcolato basato sulla formula di 1,39 micrometri quadrati al secondo.
Il profilo di linea dopo il fotosbiancamento e il profilo di recupero della regione sbiancata si adattano rispettivamente alle equazioni quattro e cinque. La frazione mobile del doppio strato lipidico che rappresenta la frazione della popolazione sbiancata che recupera era maggiore di 0,9, indicando un buon doppio strato lipidico. L'attività della miosina ha indotto flussi di actomiosina contrattile che sono emersi in strutture astro-simili allo stato stazionario, guidando il raggruppamento locale della componente della membrana accoppiata.
Si può usare una varietà di tecniche di microscopia come la microscopia a scattering interferometrico per studiare la dinamica delle reti di actomiosina non etichettate senza indurre alcun danno fotografico, o utilizzare la microscopia a fluorescenza a super risoluzione. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori interessati a capire come i complessi proteici di membrana interagiscono con una rete dinamica di actomiosina per modulare la loro architettura e composizione.
