ここでは、膜テザーアクトミオシンネットワークを組み立て、高度な光学顕微鏡技術を使用してダイナミクスを研究するための比較的簡単で簡単な手順を示します。主な利点は、当社のアッセイにより、膜テザーネットワークを乱すことなくタンパク質や低分子を順次添加できることです。この方法は、他の細胞骨格タンパク質または複合ネットワークの研究に容易に適合させることができる。
プロトコルの最も重要な部分は、サポートされている脂質二重層が正しく形成されることを確認することであるため、まず、細胞骨格タンパク質の追加を開始する前に、このステップを習得する必要がありました。まず、3〜5枚の長方形のガラスカバースリップを取り、コプリンジャーの中に置きます。バス超音波処理器の電源を入れ、温度を摂氏65度に設定します。
カバーガラスを完全に沈めるために2%洗浄液でcoplinジャーを満たし、フルパルスモードで30分間超音波処理器に入れます。鈍いPTFEコーティングされた鉗子を使用して、カバーガラスを1つずつ取り除きます。蒸留水でそれらを完全にすすぎ、2つの通常の水酸化ナトリウムで満たされた別のコプリンジャーに入れます。
フルパルスモードで20分間カバーガラスを超音波処理します。カバーガラスを取り外し、蒸留水で十分にすすぎ、蒸留水で満たされた別のコプリンジャーに入れます。実験を開始する前に、窒素ガス供給を備えた化学フードに瓶を入れてください。
手袋と鉗子を使用してカバーガラスを取り外し、窒素気流下で乾燥させます。両面を乾かし、カバー付きのきれいなプラスチックグリッドの上に置きます。カバーガラスの入った箱をデシケーターに入れてほこりの粒子との接触を避け、オートクレーブ滅菌したPCRチューブを取り、鋭い手術用ブレードで蓋と下部の円錐形の半分を切り取ります。
円筒形のハーフカットチューブを取り、各カットチューブの滑らかなリムにUV硬化型接着剤を塗布し、リムがカバーガラスに平らになるように、新しく掃除したカバースリップの上に逆さまに置きます。接着剤がチャンバーの中央スペースにこぼれないように、カバーガラスに配置したらシリンダーを横方向に動かさないでください。カバーガラスをベアリングするチャンバーを、酸素供給と真空を備えたUVオゾンクリーナーの中に置きます。
UVライトをオンにして3〜5分間点灯させ、接着剤を重合させます。カバーガラスを取り出し、チャンバーの漏れをテストし、漏れのあるチャンバーを廃棄します。各チャンバーをSLB形成バッファーで洗浄し、最後に100マイクロリットルのバッファーを残します。
永久マーカーで100マイクロリットルのバッファーのレベルをマークし、次にチャンバーに2マイクロリットルの0.1モル塩化カルシウムを加え、続いて各チャンバーに8マイクロリットルのSUV溶液を加え、摂氏25度で15分間インキュベートします。サンプルチャンバーに50マイクロリットルだけを残して50マイクロリットルのSLB形成バッファーを除去し、次に100マイクロリットルのXKMEHをチャンバーに加え、穏やかに混合します。底に触れずに100マイクロリットルのバッファーを取り除きます。
100マイクロリットルのXKMEHを加え、100マイクロリットルを取り出して、洗浄を8〜10回繰り返します。1ミリリットルのベータカゼイン1ミリグラムを10マイクロリットル二層に加え、穏やかに混合し、室温で5〜10分間インキュベートします。ベータカゼインを1つのXKMEHで3回洗い流し、バッファーレベルを100マイクロリットルのマークに戻します。
ベータカゼインのインキュベーション中に、摂氏37度で急速に解凍したマイナス80°Cの膜アクチンリンカータンパク質のアリコートを取り出し、氷上に置きます。アリコートをタンパク質希釈バッファーで1マイクロモルの濃度に希釈します。リンカータンパク質を定義された最終濃度で溶液に加え、穏やかに混合します。
室温で30〜40分間インキュベートし、1つのXKMEHバッファーで3〜5回洗浄して、結合していないHSEタンパク質を除去します。各チャンバーのバッファーレベルを100マイクロリットルのマークに戻します。これで、サンプルをイメージングする準備が整いました。
顕微鏡、励起レーザー、検出カメラの電源を入れます。レーザーの位置が整い、対物レンズが洗浄され、ソフトウェアが画像を取得する準備ができていることを確認します。100倍の対物レンズにオイルを塗り、サンプルを顕微鏡ステージにマウントし、対物レンズを二重層に集中させます。
レーザーの位置がサンプル上で全反射を受けるようなものであることを確認してください。488ナノメートルの励起を使用します。二重層の完全性を判断するには、二重層上の関心領域を選択し、5対1以上のS/N比を提供するイメージング条件を使用して視野のいくつかの画像を記録することにより、迅速なFRAPアッセイを実行します。
記録を一時停止し、TIRF顕微鏡のフィールドダイアフラムを閉じて、集中レーザービームを二重層の小さな円形領域に集中させ、蛍光色素を局所的に漂白します。レーザーを最大出力までオンにして、小さな領域を3〜10秒間光退色してから、レーザーをオフにします。視野絞りを元の半径に再度開き、イメージング条件をプレブリーチ設定に再調整し、すぐに視野内の蛍光信号の回復の記録を再開します。
二重層が流動的かどうかを確認し、画像を16ビットドットTIFファイルとして保存します。標識されていないG-アクチンと蛍光標識されたG-アクチンを10対1のモル比で混合し、G-アクチンの濃度が20マイクロモルになるようにG-バッファーを補充します。1回限りの溶液を得るために、10倍MEバッファーの10分の1をミックスに加え、室温で2分間インキュベートします。
次に、キャッピングプロテインストックのバイアルを摂氏37度ですばやく解凍し、氷の上に置きます。キャッピングタンパク質の濃度が目的の最終濃度の2倍になるようにGバッファーで希釈し、等量の希釈キャッピングタンパク質溶液をアクチンミックスに加えます。最後に、等量の新鮮な2倍の標的緩衝液を反応ミックスに加える。
溶液の最終容量は、アクチンミックスの体積の4倍にする必要があります。成分の最終濃度がテキスト原稿に記載されているとおりであることを確認してください。サンプルを摂氏25度の暗所で45〜60分間インキュベートして、重合を可能にします。
鈍い端のピペットチップで5マイクロモルの重合アクチンを静かにピペットで取り出し、清潔なオートクレーブ滅菌PCRチューブに加えます。XKMEHをチューブに1つ加えて最終容量を20マイクロリットル以上にし、F-アクチンのせん断を避けるために穏やかに混合します。マウントされたサンプルチャンバーから、等容量のバッファーを除去します。
重合アクチン溶液をチャンバーに加え、底部の二重層に触れずにゆっくりと上下に3回ピペットで留めます。サンプルをTIRF顕微鏡にマウントし、20〜30分間休ませます。F-アクチン添加が定常状態に達した後、異なる視野からいくつかの画像を記録します。
アクチンインキュベーションを30分行った後、サンプルを顕微鏡に戻します。リンカータンパク質とF-アクチンチャネルのシグナルを確認します。必要に応じて撮影条件を調整してください。
長時間のタイムラプス録画に適したリージョンを選択してください。ミオシン添加前に0.1〜0.2ヘルツで10〜15フレーム記録し、記録を一時停止します。鈍端のピペットチップでストックバイアルから必要量のリサイクル筋肉ミオシン2個をピペットで取り出し、清潔なオートクレーブ処理PCRチューブに加えます。
すぐに1つのXKMEHをチューブに加えて容量を20マイクロリットル以上にし、穏やかに混合します。マウントされたサンプルチャンバーから等量のKMEHバッファーを邪魔することなく慎重に取り出し、ミオシン溶液をサンプルチャンバーに静かに加えます。表面結合フィラメントを乱すため、上下にピペットしないでください。
すぐにタイムラプス録画を再開し、すべての画像を保存してから、バッファのみのサンプルを使用してすべてのチャンネルの背景画像を撮影します。すべての画像をTIFファイルとして保存します。拡散係数の適合値は毎秒1.34平方マイクロメートルであり、式に基づく計算値である毎秒1.39平方マイクロメートルとほぼ一致した。
光退色後のラインプロファイルおよび漂白領域の回収プロファイルは、それぞれ式4および5に適合する。回復する漂白集団の割合を表す脂質二重層の可動画分は0.9より大きく、良好な脂質二重層を示す。ミオシン活性は、定常状態でアストロ様構造に出現する収縮性アクトミオシン流を誘導し、結合膜成分の局所的なクラスタリングを促進します。
干渉散乱顕微鏡などのさまざまな顕微鏡技術を使用して、光損傷を誘発することなく非標識アクトミオシンネットワークのダイナミクスを研究したり、超解像蛍光顕微鏡を使用したりできます。この技術は、膜タンパク質複合体が動的アクトミオシンネットワークと相互作用してその構造と組成を調節する方法を理解することに関心のある研究者に道を開きます。
