Cette méthode est dédiée à l’étude du rôle des microtubules lors de l’invasion du cancer du cerveau en couplant l’injection atopique de cellules cancéreuses du cerveau chez le poisson zèbre à l’imagerie intravitale sous-cellulaire. Le principal avantage de la technique réside dans la haute résolution temporelle spatiale à laquelle le cytosquelette des microtubules est acquis. Il est unique pour les modèles in vivo d’invasion du cancer du cerveau et permet une analyse approfondie de la dynamique des microtubules.
L’imagerie subcellulaire de l’invasion in situ des cellules cancéreuses du cerveau peut être utilisée pour l’analyse de toute protéine d’intérêt potentiellement impliquée dans l’invasion du cancer. Pour commencer, lavez les cellules de glioblastome cultivées à 37 degrés Celsius avec du PBS. Détachez les cellules en ajoutant un millilitre de 0,05% de trypsine EDTA et en incubant pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius dans l’incubateur cellulaire jusqu’à ce que toutes les cellules soient complètement détachées.
Resuspendre les cellules dans cinq millilitres de milieu cellulaire de glioblastome complet dans un tube centrifuge de 50 millilitres. Ajouter 45 millilitres de PBS glacé et centrifuger à 134 fois G pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension avec un millilitre de PBS glacé en pipitant de haut en bas soigneusement.
Ajouter 49 millilitres de PBS glacé et centrifuger à 134 fois G pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 200 microlitres de PBS glacé. Conserver sur de la glace pendant toute la durée de la procédure de transplantation.
Pour micro-injecter les cellules du glioblastome dans le mésencéphale des larves de poisson zèbre, remplissez une plaque moulée de micro-injection avec six millilitres de milieu E3 supplémentés en 160 milligrammes par litre de tricaïne. Transférer une douzaine de larves DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED dans la plaque de micro-injection. Une fois que les larves sont anesthésiées et totalement insensibles au toucher, alignez-les dans les tranchées de leur côté, la tête haute et le sac vitellin poussé contre le mur de la tranchée avec un pinceau de taille 00.
Ensuite, chargez cinq microlitres de cellules de glioblastome dans le micro-capillaire à l’aide d’embouts de microchargement et insérez le capillaire dans le support capillaire universel. Placez la plaque de microinjection contenant les larves anesthésiées sur la platine du stéréomicroscope. Placez la pointe du micro-capillaire sur le bord de la plaque de micro-injection à l’aide des boutons du micro-manipulateur.
Ensuite, cassez avec un scalpel pour créer un point d’entrée pointu à peu près de la taille du diamètre d’une cellule. Vérifiez que les cellules s’écoulent du capillaire en faisant couler doucement de l’huile dans le micro-injecteur et en plongeant l’extrémité de l’aiguille dans le milieu. Concentrez les cellules à l’extrémité du capillaire pour maximiser le nombre de cellules injectées par volume injecté et éviter de remplir le tissu cérébral avec du PBS.
Examinez attentivement les cellules qui sortent du micro-capillaire lorsque de l’huile est introduite manuellement dans l’injecteur. Définissez empiriquement le nombre de tours nécessaires sur le bouton manuel pour fournir 20 à 50 cellules. En règle générale, si les cellules sont suffisamment concentrées, un léger tour suffit pour éjecter environ 10 cellules.
Approchez la pointe du capillaire contre le tectum optique gauche juste au-dessus de la veine cérébrale moyenne. Appuyez doucement le capillaire contre les larves jusqu’à ce que la membrane cutanée se brise. Une fois qu’une position appropriée dans le tectum optique est atteinte, éjectez les cellules.
Observez attentivement l’extrémité du capillaire pour visualiser le flux de cellules entrant à l’intérieur de l’animal, assurant ainsi une injection réussie. Répétez la procédure pour autant d’animaux que nécessaire. Selon la vitesse d’injection de l’expérimentateur, un changement d’aiguille pourrait être nécessaire toutes les 10 à 20 larves en raison de l’agglutination rapide des cellules dans le capillaire.
Une fois la transplantation au xéno terminée, retirez les larves de la plaque de micro-injection et sélectionnez-les dans une plaque de 24 puits remplie de PTU d’eau de source minérale et de milieu bleu de méthylène. Préparez une solution AH-KROH à bas point de fusion à 1%. Transférez 500 microlitres de solution bouillie d’AH-KROH à bas point de fusion à 1% dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre et laissez-le refroidir à 37 degrés Celsius sur un bloc thermique.
ajouter 160 microgrammes par litre de tricaine à l’AH-KROHS et bien mélanger. Transférer une à quatre larves xénogreffées dans une boîte de Petri de 3,5 centimètres remplie de PTU d’eau de source minérale et de milieu de méthylène, complétée par 160 microgrammes par litre de tricaïne. Une fois que les larves sont anesthésiées et ne répondent pas du tout au toucher, transférez-les soigneusement dans le tube contenant l’AH-KROHS et la tricaïne à l’aide d’une pipette de transfert à pointe fine.
Mélangez délicatement la larve avec l’AH-KROHS. À l’aide d’une grande pipette de transfert à bulbe, placer les larves mélangées dans l’AH-KROHS au centre d’une antenne d’imagerie vidéo de 3,5 centimètres à fond de verre Sous un stéréomicroscope, positionnez rapidement les larves sur son dos. À l’aide d’une pointe de micro-chargement, retirez les AH-KROHS supplémentaires pour maintenir la couche AH-KROHS la plus fine possible.
Une fois que AH-KROHS s’est solidifié, ajoutez 2,5 millilitres de milieu d’imagerie. Pour l’imagerie in vivo de la dynamique des microtubules dans les cellules envahissantes de glioblastome, placez la parabole d’imagerie vidéo contenant les larves xénogreffées intégrées AH-KROHS dans la chambre environnementale d’un microscope confocale inversé avec une température réglée à 32 degrés Celsius. Trouvez les larves dans la parabole d’imagerie vidéo avec un objectif 10x à l’aide d’une scène XY motorisée.
Appuyez sur l’échappement pour abaisser la tourelle des objectifs et ajoutez de l’huile minérale sur un objectif d’huile 60x, puis appuyez sur l’échappement pour revenir à la position focale initiale. Observez les cellules envahissantes du glioblastome dans le canal rouge réglé sur une source laser de 561 nanomètres, une puissance laser de 20% et une exposition temporelle de 200 millisecondes. Sélectionnez ensuite une cellule avec un réseau de microtubules étalé et des filaments de microtubules facilement reconnaissables.
Définissez les paramètres de la série Z. À l’aide d’un piézo-étage de 200 micromètres, sélectionnez les positions supérieure et inférieure du réseau de microtubules où une pile Z de 10 à 30 micromètres de profondeur est suffisante pour visualiser le réseau microbien dans la saillie de la cellule migrante avec un pas de tranche Z de 0,3 micromètre. Définissez les paramètres d’acquisition en accéléré pour permettre un équilibre optimal entre la vitesse d’acquisition, la profondeur de la pile Z et le signal fluorescent afin d’éviter un blanchiment rapide des photos.
Acquérir des images des microtubules toutes les cinq à 10 secondes pendant plusieurs minutes et enregistrer l’hyper-pile 5D. La dynamique des microtubules a été mesurée en construisant un kymographe le long des microtubules en croissance et en rétrécissement et en suivant manuellement les bords individuels des microtubules au fil du temps. Le traitement médicamenteux administré dans le milieu larvaire et son effet réversible sur l’organisation du réseau de microtubules ont été évalués en traitant avec une dose nanomolaire de 200 nanomolaires de nocodazole.
Cela a entraîné un rétrécissement progressif du réseau de microtubules et la disparition de la saillie cellulaire du glioblastome après quatre heures. Le lavage du médicament a restauré la capacité des cellules de glioblastome à former des protubérances. Les cellules ont repris leur migration le long du système vasculaire 12 heures après le lavage, ce qui indique qu’une dose de 200 nanomoles de nocodazole était suffisante pour perturber le réseau de microtubules et bloquer rapidement l’invasion in vivo des cellules de glioblastome.
Une analyse de trois jours du même traitement sur l’invasion cellulaire globale du glioblastome a révélé que le nocodazole arrêtait l’invasion à long terme des cellules de glioblastome in vivo sans affecter la santé générale du poisson par rapport à un témoin. N’oubliez pas de commencer avec des larves en bonne santé trois jours après la fécondation pour concentrer les cellules dans le capillaire, minimiser le volume injecté dans le cerveau et former une masse tumorale unique, et essayez d’éviter d’injecter dans les ventricules cérébraux.
