Ce protocole permet le développement de l’élimination des cellules musculaires dans n’importe quel gène, afin d’étudier plus avant la fonction de ce gène dans le muscle. L’avantage est qu’il est bon marché et plus rapide que le développement d’animaux knock-out d’étudier n’importe quel gène. Cette technique peut être utilisée, par exemple, pour étudier l’implication d’un gène nouvellement identifié dans une myopathie.
Si la technique décrite ici est appliquée aux cellules iPS, elle peut conduire au développement de cellules knock-out pour n’importe quel gène dans n’importe quel type de cellules. Pour commencer à regrouper régulièrement de courtes répétitions palindromiques espacées ou une délétion génique médiée par CRISPR, utilisez d’abord des outils de navigateur de génome comme ensembl. org pour identifier le gène cible ainsi que les séquences d’ADN des deux côtés de celui-ci.
Pour obtenir la liste des exons du gène, cliquez d’abord sur la transcription de la séquence codante de la protéine, puis sur Exons. Ensuite, cliquez sur Télécharger la séquence et sélectionnez uniquement séquence génomique pour télécharger la séquence de consensus complète de l’ensemble du gène. Faites défiler la liste des exons et des introns du gène pour sélectionner ceux qui sont ciblés.
Pour concevoir l’ARN guide, sélectionnez d’abord les séquences nucléotidiques des introns immédiatement en amont et en aval de la séquence cible. Ensuite, allez sur un site Web tel que crispr.tefor. net et utiliser les séquences sélectionnées pour concevoir deux ARN guides, chacun de 20 nucléotides de long sans le protospacer adjacent Motif séparé par quelques centaines de paires de bases.
Déterminez ensuite la séquence du complément inverse pour chaque ARN guide et ordonnez les amorces. Pour construire des cassettes d’ARN guides pour le clonage de plasmides, exécutez d’abord une PCR avec un ensemble d’amorces en utilisant la recette et le programme décrits dans le texte, puis séparez les produits pcR dans un gel d’agarose à 1% à l’aide d’un tampon Tris-borate-EDTA. Ensuite, éliminez le fragment de paire de 300 bases et purifiez-le à l’aide d’un kit.
De même, après avoir exécuté une autre PCR avec l’autre ensemble d’amorces, purifiez un fragment d’ADN long de 400 bases en 20 microlitres de tampon d’élution. Pour insérer les cassettes d’ARN guide dans un squelette plasmidique lentiviral, mettez d’abord en place une double réaction de digestion du plasmide avec les enzymes de restriction Xma 1 et Blp 1 comme décrit dans le texte. Après avoir incubé le tube réactionnel à 37 degrés Celsius pendant une heure, incubez-le à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes, puis exécutez le produit de digestion dans un gel d’agarose à 1% et purifiez le plasmide d’environ 10 paires de kilobases à l’aide d’un kit approprié.
Quantifiez également le produit purifié en mesurant la densité optique. Pour ligaturer la cassette d’ARN guide avec le plasmide, préparez un mélange réactionnel avec l’ARN guide purifié, l’ADN plasmidique linéarisé, l’enzyme et l’eau jusqu’à un volume final de 10 microlitres, puis incubez le tube de réaction à 50 degrés Celsius pendant 15 minutes pour générer le plasmide final, appelé pGuide. Pour la production de lentivirus, commencez par semer une plaque de 145 centimètres avec 1 million de cellules HEK 293 dans du DMEM avec un taux élevé de glucose et de pyruvate complété par 10% FBS et 1% de pénicilline ou de streptomycine.
Ensuite, cultivez les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois jours dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone. Le quatrième jour, vérifiez les cellules pour vous assurer d’une confluence de 60 à 65%. Ensuite, préparez la solution de transfection composée du plasmide d’intérêt, du plasmide codant pour l’enveloppe du virus, du plasmide d’emballage lentiviral psPAX2 et du phosphate de calcium.
Réglez le volume final à 1000 microlitres avec de l’eau. Ensuite, ajouter la solution de transfection goutte à goutte à un millilitre de 2X HBS sous agitation et incuber à température ambiante pendant au moins 10 minutes. Après cela, ajoutez la solution goutte à goutte aux cellules.
Pour une distribution homogène de la solution de transfection, inclinez doucement la plaque dans toutes les directions, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone pendant au moins cinq heures. Ensuite, retirez le support des plaques et lavez les cellules avec du PBS pour vous débarrasser des réactifs de transfection, puis ajoutez 12 millilitres de milieu frais. Après 48 heures d’incubation à 37 degrés Celsius, regrouper le milieu de toutes les plaques dans un tube.
Mettez le tube dans un seau scellé et centrifugez à 800 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis filtrez le surnageant à l’aide d’un filtre de 0,45 micromètre et centrifugez le filtrat à 68 300 fois G pendant deux heures à quatre degrés Celsius, à l’aide d’un rotor à godet oscillant. Après avoir retiré le surnageant, gardez les tubes à l’envers sur une serviette en papier dans une armoire de sécurité pendant cinq à 10 minutes pour éliminer au maximum le liquide des granulés. Ajouter 100 microlitres de milieu de prolifération HEC et maintenir les tubes à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures.
Ensuite, remettez en suspension la pastille par pipetage. Après avoir collecté toutes les pastilles remises en suspension, faites des aliquotes de 10 ou 25 microlitres, puis stockez les aliquotes à moins 80 degrés Celsius après congélation instantanée dans de l’hydrogène liquide. Pour la transduction des myoblastes, commencez par ensemencer chaque puits d’une plaque de 96 puits avec 100 microlitres de milieu de prolifération contenant 10 000 cellules myoblastiques.
Le lendemain, ajoutez des volumes précalculés de guides BT et de LV Cas9 aux cellules d’une armoire de sécurité. Après cinq jours d’incubation, libérez les cellules du puits en ajoutant de la trypsine. Après avoir compté le nombre de cellules, transférez les cellules des puits avec une confluence de 40 à 50% vers une nouvelle plaque.
Après cinq heures d’incubation, ajouter les volumes calculés de tueur LV à une multiplicité d’infection de 20 et incuber pendant cinq à 10 jours ou au moins deux passages entre les deux. Pour la caractérisation fonctionnelle des clones génétiquement modifiés par imagerie calcique, plaque 50 000 cellules au centre d’une boîte de 35 millimètres recouverte de laminine. Pour induire la différenciation, ajoutez le support de différenciation décrit dans le texte.
Après six jours d’incubation, retirez le milieu de culture et délimitez les cellules avec un stylo hydrophobe. Ajoutez ensuite 50 microlitres de Fluo-4 Direct, dilués un à un dans un milieu de différenciation, aux myotubes différenciés. Après avoir incubé la vaisselle à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, lavez les cellules deux fois avec un tampon Krebs complété par un milligramme par millilitre de glucose.
Ensuite, utilisez un microscope à fluorescence inversée ou un microscope confocal avec un objectif 10X pour mesurer les variations de fluorescence à une fréquence d’une image par seconde pendant 90 secondes et choisissez un champ avec au moins 10 myotubes. Après avoir retiré le tampon Krebs supplémentaire, stimuler les cellules avec deux millilitres de chlorure de potassium pour la dépolarisation de la membrane ou deux millilitres de florochloral métacrésol ou 4CmC ou RyR1 stimulation directe. Visualisez la variation de fluorescence après stimulation, puis quantifiez la variation de fluorescence dans chaque myotube.
Ce protocole pourrait être utilisé avec succès pour éliminer le gène RyR1 des myoblastes humains, ce qui a entraîné une réduction de l’ADN génomique dans les cellules. L’élimination de RyR1 a également été confirmée au niveau de la protéine, car la protéine RyR1 n’a pas pu être détectée dans les cellules ciblées par transfert Western. L’absence d’activité de RyR1 dans les myotubes différenciés des cellules knock-out de RyR1 a été vérifiée par imagerie calcique Fluo-4 après stimulation directe de RyR1 par 4CmC ou stimulation indirecte par dépolarisation membranaire induite par le chlorure de potassium.
La séquence qui sera supprimée devrait être nécessaire à la prédiction d’une protéine fonctionnelle. Cette technique est idéale pour le développement d’outils post-génomiques permettant d’étudier l’implication d’un nouveau gène dans les maladies musculaires.
