Notre protocole est une méthode in vivo pour étudier les fonctions autonomes cellulaires de la FMRP pendant le développement. Cela peut aider à comprendre la physiopathologie spécifique au type cellulaire du syndrome de l’X fragile. Cette méthode utilise l’électroporation spécifique au stade, au site et à la direction d’un système vectoriel inductible par médicament contenant de l’ARN en épingle à cheveux Fmr1.
Avec cette méthode, nous obtenons le knockdown FMRP sélectif dans le circuit auditif. Cette méthode peut également être appliquée pour étudier la fonction d’autres gènes dans le circuit auditif ou le système vestibulaire. Commencez par placer les œufs horizontalement pour positionner l’embryon sur le dessus de l’œuf pour faciliter la manipulation.
Incuber à 38 degrés Celsius pendant 46 à 48 heures jusqu’à Hamburger et Hamilton, ou HH stade 12, pour la transfection du tube neural ou pendant 54 à 56 heures jusqu’à HH 13 pour la transfection d’otocystes. Retirez les œufs de l’incubateur, une douzaine d’œufs à la fois. Garder les œufs hors de leur incubateur pendant plus d’une heure introduit des variations de développement et réduit la viabilité.
Utilisez une lampe de poche pour projeter la lumière du fond de l’œuf. L’emplacement de l’embryon apparaît comme une zone sombre sur la coquille de l’œuf. Marquez l’emplacement de l’embryon sur la coquille de l’œuf avec un crayon.
Essuyez les œufs avec de la gaze contenant 75% d’éthanol et percez un trou dans l’extrémité pointue des œufs à l’aide de la pointe des ciseaux. Ensuite, retirez deux millilitres d’albumine avec une seringue à aiguille de calibre 18. Assurez-vous que le trou est juste assez grand pour permettre l’insertion de l’aiguille.
Essuyez toute fuite d’albumine avec de la gaze et scellez le trou avec du ruban adhésif transparent. Couvrez le dessus des œufs avec du ruban adhésif transparent, en vous concentrant sur la zone sombre marquée au crayon pour minimiser les fissures et empêcher les débris de coquille de tomber pendant la fenêtrage. Essuyez tous les outils chirurgicaux avec de la gaze contenant 75% d’éthanol et essuyez la zone recouverte de ruban adhésif avec 75% d’éthanol.
Utilisez une petite paire de ciseaux pour couper une fenêtre d’un à deux centimètres carrés autour de la circonférence de la marque de crayon. Tenez les ciseaux à plat pour éviter d’endommager l’embryon en dessous. Placez l’œuf fenêtré sous un stéréomicroscope avec un oculaire 10X et un zoom 2X.
Remplissez une seringue d’un millilitre avec la solution d’encre, puis ajustez une aiguille de calibre 27. Pliez l’aiguille à un angle de 45 degrés avec une pince. Sous le microscope, piquez soigneusement le bord de la zone opaqua et insérez l’aiguille sous l’embryon.
Injectez environ 50 microlitres d’encre, qui diffuseront sous la zone pellucide, pour la visualisation de l’embryon. L’encre formera un fond sombre pour la visualisation claire de l’embryon. Tirez les capillaires en verre dans les pipettes à l’aide d’un extracteur de pipettes.
Sous un microscope à dissection, ouvrez soigneusement la pointe de l’aiguille capillaire à 10 à 20 micromètres de diamètre avec une pince. Conserver les pipettes dans une boîte de rangement jusqu’à utilisation. Ensuite, remplissez une pipette capillaire avec 0,5 à 1 microlitre du mélange plasmidique en appliquant une pression négative à travers un tube en caoutchouc à l’extrémité de la pipette avec une seringue.
Placez l’œuf sous le microscope de sorte que l’embryon soit orienté verticalement avec la queue près de vous. Tenez la pipette capillaire d’une main ou avec le manipulateur à trois axes et enfoncez l’extrémité de la pipette jusqu’au rhombomère 5 à 6. dans une direction de queue à tête.
Poussez doucement l’embout à travers la membrane vitelline et dans le tube neural dorsal, puis retirez un peu la pipette pour que l’embout soit dans la lumière du tube neural. Injecter le mélange plasmidique en appliquant une pression d’air jusqu’à ce que le plasmide teinté diffuse complètement dans le rhombomère 5 à 6 et s’étende dans le rhombomère 3 et le rhombomère 4. Vérifiez la réussite de l’injection, qui est obtenue lorsque la solution plasmidique bleue diffuse rapidement dans le tube neural sans fuite.
En cas de fuite, le bleu s’estompe rapidement. Immédiatement après l’injection, placez une électrode bipolaire en platine de chaque côté du tube neural. Délivrez deux impulsions de 12 volts et une durée de 50 millisecondes avec un électroporateur.
Observez les bulles d’air aux extrémités de l’électrode bipolaire, avec plus du côté négatif. Vérifiez que l’électroporation est réussie, ce qui est obtenu lorsque le mélange plasmidique teinté pénètre dans le tissu du tube neural près du côté positif de l’électrode. Après l’électroporation, retirez délicatement l’électrode bipolaire.
Couvrir la fenêtre sur la coquille d’œuf avec un morceau de film transparent prédécoupé en carrés de deux pouces et pulvérisé avec de l’éthanol à 75%. Replacez l’œuf dans son incubateur. Nettoyez l’électrode bipolaire en délivrant 10 à 20 impulsions de 12 volts et une durée de 50 millisecondes dans une solution saline avant de passer à l’œuf suivant.
Au microscope, placez l’œuf de manière à ce que l’embryon soit vertical avec la queue près de vous. Tenez la pipette capillaire et piquez doucement l’otocyste droit dans la direction dorsolatérale. Injecter le mélange plasmidique avec la pression de l’air jusqu’à ce que l’otocyste soit rempli de solution bleue.
Vérifiez une injection réussie, qui est obtenue lorsque le mélange plasmidique bleu est confiné dans l’otocyste et ne fuit pas. Immédiatement après l’injection, placez l’électrode bipolaire sur l’otocyste et positionnez les côtés positif et négatif antérieur et postérieur à l’otocyste, respectivement. Délivrez deux impulsions de 12 volts et une durée de 50 millisecondes avec l’électroporateur.
Vérifiez que l’électroporation est réussie, ce qui est obtenu lorsque le mélange plasmidique bleu pénètre dans le tissu de l’otocyste près du côté positif de l’électrode. Après l’électroporation, retirez soigneusement l’électrode bipolaire et couvrez la fenêtre de la coquille d’œuf avec un film transparent. Enfin, remettez l’œuf dans l’incubateur.
L’image représentative montre un exemple de troisième jour embryonnaire, ou E3, après la transfection du tube neurologique et le traitement dox au deuxième jour embryonnaire, ou E2. Les cellules transfectées avec Fmr1 shRNA et EGFP sur la section transversale sont montrées ici. Les cellules exprimant l’EGFP ont été confinées à un côté du tube neural et du tronc cérébral. Une coupe efficace à E15 avec le noyau magnocellularis, ou neurones NM, exprimant l’EGFP, du côté transfecté est montrée ici.
Du côté controlatéral, des axones contenant de l’EGFP ont été observés dans la partie ventrale du noyau laminaire, ou NL. L’effet knockdown de Fmr1 shRNA a été validé par des réductions marquées de l’immunoréactivité FMRP dans les neurones NM transfectés par rapport aux neurones voisins non transfectés. Le ganglion auditif à E19 avec immunoréactivité FMRP est montré ici. Les neurones ganglionnaires auditifs n’ont pas été transfectés.
Certaines cellules gliales dérivées des cellules de la crête neurale crânienne ont été transfectées. Les images représentatives montrent le FMRP knockdown dans le conduit auditif après la transfection d’otocystes. Les conduits auditifs à E9 présentaient une fluorescence EGFP étendue.
Sur les coupes transversales, les cellules exprimant l’EGFP étaient situées dans la papille basilaire et le ganglion auditif. L’effet knockdown de Fmr1 shRNA a été validé par une réduction de l’immunoréactivité FMRP dans les cellules ciliées transfectées par rapport aux cellules ciliées non transfectées voisines. De même, l’immunoréactivité de la FMRP a été largement diminuée dans les neurones ganglionnaires auditifs transfectés.
La projection centrale des neurones ganglionnaires auditifs transfectés a été suivie jusqu’au tronc cérébral via le nerf auditif avec des terminaisons caractérisées. En essayant cette procédure, le plus important est de contrôler le site et la direction de l’électroporation pour la transfection sélective. Après cette procédure, le remplissage de type unicellulaire, l’immunomarquage, le tri cellulaire suivi d’un spectre de masse ou le séquençage unicellulaire peuvent être effectués pour révéler les changements aux niveaux morphologique et biochimique.
Cette technique permet également l’édition sélective d’autres gènes avec contrôle temporel et spécificité des composants dans l’oreille auditive pour les circuits souches et peut être modifiée pour manipuler le système vestibulaire.
