Le protocole offre une alternative non chirurgicale précise, sûre et efficace aux méthodes d’injection chirurgicales et aveugles traditionnelles. C’est aussi la technique d’injection la plus précise pour les thymus atrophiques chez les souris âgées ou immunodéficientes. Le principal avantage est une procédure d’injection peu stressante, très sûre et précise, mais aussi rapide, permettant ainsi des expériences à grande échelle sans compromettre les données de l’immunosuppression chirurgicale liée au stress.
Maintenir l’alignement de l’aiguille et du transducteur tout en l’avançant à travers la paroi thoracique demande un peu de pratique. Nous recommandons donc de collaborer avec un radiologue interventionnel expérimenté pour effectuer des injections ou fournir une formation. Shaina Anuncio, une technicienne de mon laboratoire, aidera à démontrer la procédure.
Pour commencer, appliquez une fine couche de crème dépilatoire sur la région antérieure de la poitrine des souris pendant moins d’une minute pour enlever la fourrure. Utilisez une serviette en papier humide pour enlever la crème et la fourrure lâche. Confirmer la profondeur anesthésique appropriée en ne répondant pas au pincement de la patte postérieure.
Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir le dessèchement de la cornée. Placez une souris à la fois en décubitus dorsal sur la plate-forme chauffée de la station d’imagerie par ultrasons pour petits animaux avec le cône nasal en place. Fixez la souris à la scène avec du ruban adhésif médical au niveau des membres postérieurs et antérieurs.
Désinfectez la peau supérieure du thorax sans fourrure à l’aide d’un applicateur de gluconate de chlorhexidine. Activez la sonde linéaire la plus haute fréquence disponible. En règle générale, la sonde avec la résolution spatiale la plus élevée pour la taille de l’animal à imager.
Activez la sonde en appuyant sur le bouton correspondant après l’écran de démarrage. Pour optimiser les paramètres d’échographie pour l’imagerie et l’injection, ajustez la profondeur du champ de vision à une taille appropriée pour l’animal cible en ajustant les curseurs orientés verticalement sur le côté droit de l’écran. Ajustez le gain de l’échelle de gris en faisant glisser le bouton le long de la barre horizontale en bas de l’écran.
Ensuite, ajustez la zone focale au niveau anticipé du thymus. Appliquez environ un millilitre de gel à ultrasons sur la surface du transducteur pendant qu’il est debout, soit dans le support de l’appareil à ultrasons, soit dans les mains d’un assistant. Pour préparer un petit champ stérile à côté de la plate-forme chauffée, videz un couvercle de sonde stérile, un élastique, des gants stériles et un gel à ultrasons stérile sur le champ stérile.
Ensuite, mettez les gants stériles. Placez soigneusement le couvercle de la sonde stérile sur le transducteur à ultrasons et le gel. Pour maintenir la stérilité, ne touchez que le couvercle stérile.
Faites glisser l’élastique stérile sur le couvercle de la sonde pour le maintenir en place. Placez deux à trois millilitres de gel à ultrasons stérile sur le transducteur. Placez la sonde surmontée d’un gel à ultrasons verticalement sur la partie désinfectée de la paroi thoracique antérieure de la souris pour l’imagerie initiale, tout en maintenant la stérilité.
Visualisez et optimisez l’image échographique comme démontré précédemment. Pour scanner la poitrine antérieure de la souris dans un plan transversal, tenez le transducteur verticalement et déplacez-le de haut en bas du cou à l’abdomen dans un mouvement de pinceau ou de balayage. Avec le cœur centré dans le champ de vision, balayez légèrement le transducteur vers le cou.
Notez les deux structures noires rondes appariées de chaque côté de la partie supérieure de la poitrine. À l’aide de la sonde à ultrasons, localisez la partie la plus large du thymus, qui est généralement le site cible idéal pour l’injection. Anticipez une trajectoire horizontale de l’aiguille à l’endroit choisi et notez où se trouvent les principaux vaisseaux sanguins à cet endroit.
Ces vaisseaux doivent être évités pendant l’injection. Les vaisseaux sanguins seront des structures pulsatiles hypoéchogènes. En cas de doute, activez le mode Doppler couleur en appuyant sur le bouton de couleur à l’écran pour vérifier le débit dans les vaisseaux.
Tenez le transducteur dans une main et une aiguille à insuline de calibre 30 avec 10 microlitres d’injecter dans l’autre. Pour commencer le processus d’injection, déplacez le transducteur latéralement de sorte que le thymus soit décentré dans le champ de vision de l’échographie. Assurez-vous que l’autre côté du champ de vision se compose principalement de gel à ultrasons et de rien d’autre.
Placez la pointe de l’aiguille dans le gel sous le transducteur et déplacez lentement l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit visualisée à côté de la surface de la peau. Tout en visualisant continuellement l’aiguille sous échographie, insérez l’aiguille dans le thymus avec une trajectoire percutanée loin des vaisseaux sanguins. Utilisez une trajectoire horizontale transversale du thymus pour placer l’extrémité de l’aiguille dans le lobe thymique controlatéral au site d’entrée.
Une fois que l’extrémité de l’aiguille est à l’intérieur de la partie souhaitée du thymus, injectez rapidement le contenu de la seringue de calibre 30 tout en utilisant la visualisation échographique. Pour stabiliser la seringue pendant l’insertion et l’injection de l’aiguille, tenez la seringue entre le pouce et le troisième doigt et contrôlez le piston de la seringue avec l’index. Retirez l’aiguille une fois que tout le contenu a été déposé.
Chez les jeunes souris, l’identification du thymus était simple en raison de la grande taille de la glande. C’était plus difficile chez les souris plus âgées ou immunodéficientes. Cependant, c’était encore très faisable avec un équipement à ultrasons moderne.
Une injection réussie a été notée lorsque l’aiguille n’a pas traversé des structures critiques, telles que le cœur, l’aorte ou l’une des veines caves inférieures. La pointe de l’aiguille a été visualisée à son emplacement cible pendant l’injection, confirmant le dépôt intrathymique. L’emplacement intrathymique de l’injection a été confirmé en utilisant Luciferin comme injecter dans des souris transgéniques luciférase.
Ceux-ci ont été évalués immédiatement par imagerie par bioluminescence, confirmant l’emplacement correct de l’injection sans sacrifier l’animal. Alternativement, le bleu de trypan a été injecté comme marqueur visuel du site d’injection et de la précision de l’injection en utilisant ex vivo avec nécropsie. Notre groupe a utilisé cette technique pour plusieurs grandes études, y compris la recherche sur l’immunothérapie du cancer, basée sur l’injection de cellules progénitrices génétiquement modifiées, et pour améliorer la fonction thymique chez les souris immunodéficientes.
