Le séquençage du génome entier, WGS, peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la résistance aux antimicrobiens grâce à l’interrogation du génome et à l’identification des mécanismes moléculaires sous-jacents au phénotype de résistance aux antimicrobiens. Le séquençage mondial du génome améliore l’exploration de l’ADN et de l’ADN bactérien à grande échelle, facilitant la caractérisation approfondie des microbes en une seule fois, y compris des variantes pathogènes étroitement apparentées. Le séquençage de nouvelle génération permet d’identifier et de caractériser rapidement les micro-organismes et leur profil de résistance aux antimicrobiens en considérant un outil de diagnostic, de traitement, de surveillance et de suivi des sources d’agents pathogènes dans le contexte clinique.
Les méthodologies de séquençage de nouvelle génération peuvent jouer un rôle déterminant dans la surveillance et le suivi des sources d’agents pathogènes, non seulement dans le contexte clinique, mais aussi dans les contextes environnementaux et, surtout, dans la salubrité des aliments. Actuellement, ce n’est pas une technique de routine. En effet, un peu de la procédure permettra de mieux comprendre dans quelle mesure ils réussissent l’expérience.
La démonstration de la procédure sera assurée par Julissa Enciso-Ibarra, technicienne en génomique de notre groupe de travail. Après avoir extrait et quantifié l’ADN bactérien, ajoutez 2,5 microlitres de tampon de marquage. Deux microlitres d’entrée G D N A dans un tube de 0,2 millilitre et mélanger par pipetage.
Ajouter un microlitre de tampon d’amplification et pipette de haut en bas pour mélanger. Puis faites tourner le tube à 280 G pendant une minute. Placez les échantillons dans un thermocycleur à 55 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis maintenez à 10 degrés Celsius.
Ajouter un microlitre de tampon neutralisant dans les tubes à échantillon et mélanger doucement par pipetage. Faire tourner le tube et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez 1,7 microlitre de chaque adaptateur d’index et trois microlitres de mélange maître PCR d’indexation.
Après avoir mélangé les composants, faire tourner vers le bas à 280 G pendant une minute à température ambiante. Placez les échantillons dans le thermocycleur et effectuez une deuxième réaction de PCR comme décrit dans le manuscrit. Maintenant, mélangez la solution commerciale de billes magnétiques par vortex.
Selon les directives du fabricant. Transférer l’échantillon G D N A marqué ou indexé dans un nouveau tube de cinq millilitres et ajouter 0,6 microlitre de billes magnétiques pour chaque microlitre du volume final de l’échantillon G D N A. Mélanger délicatement les composants par pipetage et incuber pendant cinq minutes à température ambiante.
Placez les tubes à échantillon sur une grille magnétique pendant deux minutes jusqu’à ce que le surnageant soit éliminé. Jetez soigneusement le surnageant sans déranger les perles. Ajoutez ensuite 200 microlitres d’éthanol à 80% fraîchement préparé sans mélanger.
Incuber pendant 30 secondes jusqu’à ce que l’éluit soit effacé et retirer délicatement le surnageant sans déranger les perles. Répétez cette procédure et séchez les perles à l’air libre pendant 10 minutes. Ajoutez maintenant 15 microlitres de tampon tris millimolaire 10 millimolaires aux billes mélangées délicatement par pipetage et incuber pendant deux minutes à température ambiante.
Placez les tubes à échantillon sur le support magnétique pendant deux minutes pour permettre au surnageant de se dégager. Ensuite, transférez soigneusement 14 microlitres du surnageant du tube à échantillon vers un nouveau tube de 0,2 millilitre et obtenez la bibliothèque nettoyée. Décongeler la cartouche de réactif en suivant les instructions du fabricant.
Tirez cinq microlitres de la bibliothèque normalisée dans un tube de 1,5 millilitre à faible liaison et diluez la bibliothèque groupée à quatre nanomolaires avec le volume approprié de RSB. Ajoutez ensuite cinq microlitres chacun de la bibliothèque mise en commun et 0,2 hydroxyde de sodium normal dans un nouveau tube de 1,5 millilitre à faible liaison. Pour dénaturer la bibliothèque commune en brins simples, mélangez le tube en tourbillonnant.
Faire tourner vers le bas pendant une minute et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Maintenant, ajoutez 10 microlitres de la bibliothèque dénaturée en pool 990 microlitres de tampon d’hybridation pré-refroidi et mélangez doucement par pipetage. Placer le tube sur de la glace jusqu’à ce que la dilution finale pour le chargement du séquenceur soit effectuée.
Verser et préparer une bibliothèque de contrôle à une concentration de quatre nanomolaires en mélangeant deux microlitres de la bibliothèque de contrôle et trois microlitres d’eau sans nucléase. Ajoutez ensuite cinq microlitres chacun de la bibliothèque de contrôle et 0,2 hydroxyde de sodium normal fraîchement préparé. Dénaturez la bibliothèque de contrôle en brins simples comme démontré précédemment.
Mélanger délicatement 10 microlitres de bibliothèque de contrôle dénaturée et 990 microlitres de tampon d’hybridation prérefroidi par pipetage, et le placer sur la glace jusqu’à ce que la dilution finale pour le chargement du séquenceur soit terminée. Dans un nouveau tube à faible liaison, 1,5 millilitre, combinez 594 microlitres de la bibliothèque pooled dénaturée et six microlitres de la bibliothèque de contrôle dénaturée. Mélanger correctement et diluer le mélange final de la bibliothèque à une concentration de charge finale de 1,2 molaire peco dans un volume de 600 microlitres à l’aide du tampon d’hybridation prérefroidi.
Avant de charger le mélange final de la bibliothèque sur la cartouche de réactif, effectuez un prétraitement thermique supplémentaire pour obtenir un chargement efficace dans la cellule d’écoulement. Incuber le mélange final de la bibliothèque pendant deux minutes à 96 degrés Celsius. Retourner le tube pour mélanger et placer le tube sur de la glace pendant cinq minutes.
Chargez 500 microlitres du mélange final de la bibliothèque dans le réservoir de conception de la cartouche de réactif. Après avoir lancé le séquenceur, chargez la cartouche de réactif, la cellule d’écoulement et configurez le séquençage. Pour l’analyse des données, connectez-vous au serveur de données de séquençage et téléchargez les fichiers FASTQ.
Évaluez la qualité initiale des données de séquence brutes avec un logiciel tiers. Supprimez les séquences d’adaptateurs restantes, les bases de mauvaise qualité et les lectures courtes des données de séquençage brutes. Assemblez les données de séquençage du contrôle qualité au niveau contig ou échafaudage à l’aide d’un logiciel tiers.
Effectuez l’annotation du génome en soumettant le fichier Phaster contenant le génome assemblé au serveur RAST. Téléchargez le fichier Phaster sur les plateformes Web de typage du Center for Genome Epidemiology et de Claremont pour identifier les caractéristiques épidémiologiques. ARGS, VAGS et plasmides.
Téléchargez le fichier Phaster sur le serveur Phaster pour identifier les séquences de prophages. L’annotation du génome a révélé 5 633 caractéristiques codées, dont 5 524 sont des gènes de revêtement de protéines et 109 sont des séquences liées à l’ARN. La souche prévue d’Escherichia coli appartient au filo du groupe B un et au type de séquence 40.
Un déterminant de la résistance aux antimicrobiens, le gène M D F A codant pour une pompe d’efflux multi-médicaments à large spectre a été identifié. Des gènes codant pour une entérotoxine thermostable, une protéine de résistance sérique et le système de sécrétion de type trois ainsi que ses protéines effectrices sécrétées ont également été identifiés. Les séquences codantes sont regroupées en collections de protéines fonctionnellement apparentées appelées sous-systèmes, en particulier celles qui jouent un rôle fonctionnel dans les glucides, les protéines, les acides aminés et les métabolismes dérivés et le transport membranaire.
Les bonnes pratiques de laboratoire sont fondamentales dans tout le protocole. Cependant, un soin particulier doit être pris lors du traitement de plusieurs échantillons pendant la préparation de la banque d’ADN sectionnelle afin d’éviter la contamination croisée.
