Le système bactérien CRISPR-Cas9 a considérablement augmenté les options expérimentales pour les scientifiques de la vie. Cependant, plusieurs approches CRISPR dépendent de la livraison simultanée de multiples ARN guides dans les cellules individuelles. Le clonage de gRNA d’assemblage de cordes permet la génération simple et rapide de vecteurs d’expression de multiplex gRNA en une seule étape de clonage.
Mais STAgR n’est pas seulement simple, il est également efficace, bon marché et facile à personnaliser. Pour commencer, ajoutez les séquences de N20 gRNA aux amorces d’amplification avant pour la chaîne d’ADN STAgR sous forme de surplombs. Ajoutez des séquences de gRNA de sens cinq premiers à l’amorce avant, amorce avant d’échafaudage, pour un échafaudage conventionnel, ou à l’amorce avant de SAM pour un échafaudage MS2-contenant.
Ensuite, ajoutez le complément inverse des séquences N20 gRNA aux séquences d’amorce inversée, en choisissant des amorces RP, en fonction des promoteurs et des chaînes spécifiques utilisés. Pour commencer à générer les fragments de clonage individuels pour Gibson Assembly, transférez 10 microlitres du tampon haute fidélité à un tube. Ajouter un microlitre de 10 dNT Milimolar et 0,25 microlitres des deux amorces de surplomb de 100 micromolaires.
Ajouter 10 nanogrammes de la chaîne de modèle d’ADN, ou vecteur, et 1,5 microlitres de DMSO. Ajouter suffisamment d’eau pour porter le volume final à 49,5 microlitres, puis ajouter 0,5 microlitres de polymése HF. Incuber les réactions sur un thermocycleur, tel que décrit dans le protocole de texte.
Après cela, prendre un aliquot de 5,5 microlitres de la réaction PCR. Ajouter le colorant de chargement à tous les aliquots, et le charger sur un gel de 1% agarose. Chargez une échelle d’ADN appropriée pour le dimensionnement, et exécutez le gel dans un tampon approprié de gel-exécution à 120 volts pendant 30 minutes.
Pendant que le gel est en cours d’exécution, ajouter cinq microlitres du tampon fourni avec l’enzyme de restriction, et 0,5 microlitres DpnI aux 44,5 microlitres restants de la réaction vectorielle PCR pour éliminer le modèle plasmide résiduel utilisé pendant le PCR. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Vérifiez que les amplicons sont de la bonne taille.
Pour commencer la purification de l’ADN, ajouter 1,8 microlitres de perles magnétiques par microlitre de produit PCR, et mélanger par pipetting de haut en bas. Incuber à température ambiante pendant deux minutes. À l’aide d’un aimant, séparer les perles dans les fragments d’ADN du liquide résiduel.
Rincer la pastille avec 70% d’éthanol sans la réutiliser complètement, pour laver les perles. Répétez ce lavage une fois de plus. À l’aide d’une pipette, retirer tout l’éthanol et laisser sécher l’air granulé.
Ajouter ensuite 15 à 20 microlitres d’eau, et pipette de haut en bas pour mélanger et dissoudre la pastille. Utilisez un aimant pour séparer les perles du liquide. Transférer le supernatant clair dans un nouveau tube.
Après cela, utilisez un spectrophotomètre pour déterminer les concentrations d’ADN. Tout d’abord, préparez le tampon de réaction isothermal 5x tel que détaillé dans le protocole de texte. Pour le Gibson Assembly Master Mix, combinez 320 microlitres du tampon de réaction isothermale 5x avec 697 microlitres d’eau.
Ajouter 3 microlitres d’exonucléase T5, 20 microlitres de polymésase d’ADN, et 160 mciroliters de ligase d’ADN de Taq. Transférer 7,5 microlitres du Mix Maître d’Assemblage dans un tube frais. Ajoutez ensuite 2,5 microlitres d’insertion dans le vecteur, comme indiqué dans le protocole texte.
Incuber les échantillons à 50 degrés Celsius pendant 45 à 60 minutes. Après cela, entreposer des échantillons sur de la glace, ou à 20 degrés Celsius, pour une transformation ultérieure. Lorsqu’elles sont prêtes à transformer la bactérie, décongelez les bactéries TOP10 E.Coli chimiquement compétentes sur la glace.
Ensuite, ajoutez cinq microlitres du Gibson Mix à 50 microlitres de bactéries compétentes, et mélangez en feuilletant doucement le fond du tube. Incuber sur la glace pendant 30 minutes. Placez le tube dans un bain d’eau ou un bloc de chaleur de 42 degrés Celsius pendant 45 secondes pour choquer la bactérie.
Ensuite, remettre les tubes sur la glace. Ajouter 250 microlitres de SOC moyen à la bactérie, et les laisser récupérer à 37 degrés Celsius dans un incubateur secouant pendant 30 à 45 minutes. Une fois que les bactéries se sont rétablies, plaquez-les sur des plaques d’agar de 1,5 % LB qui contiennent 100 microgrammes par ampicilline millilitre.
Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Pour commencer, préparez au moins deux ensembles de 200 tubes de réaction PCR de microlitres pour chaque construction. Remplissez l’un des ensembles de tubes de réaction avec 100 microlitres LB moyens, contenant 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline.
À l’aide d’une pointe stérile de pipette, grattez le matériel biologique d’une colonie bactérienne et étalez-le au fond d’un tube de réaction PCR vide de 200 microlitres. Transférez immédiatement la pointe pipette vers le deuxième tube de réaction correspondant qui contient du milieu LB. Faites tourbillonner la pointe pour vous assurer que certaines des bactéries sont transférées aux médias LB.
Incuber à 37 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Ensuite, préparez 10 microlitres de PCR Master Mix par tube de réaction, tel que décrit dans le protocole texte. Ajoutez 10 microlitres du MIX PCR Master aux tubes de réaction PCR étiquetés, sans les supports LB.
À l’aide d’un thermocycleur, incuber les réactions décrites dans le protocole textuel. Après cela, ajouter le colorant de chargement aux fragments amplifiés, et les charger sur un gel de 1% agarose. Chargez une échelle d’ADN appropriée pour le dimensionnement, et exécutez le gel dans un tampon approprié de gel-exécution à 120 volts pendant 30 minutes.
Calculez la taille théorique de l’amplicon en additionnant les tailles individuelles des promoteurs utilisés, les échafaudages gRNA et le nombre de séquences N20. À partir des résultats de la colonie PCR, identifier les clones bactériens, en fonction de la taille correcte de la bande, et si elles sont susceptibles d’abriter des vecteurs corrects. En utilisant la culture correspondante de 100 microlitres, inoculer une culture LB de 2,5 millilitres pendant la nuit contenant 100 microgrammes par ampicilline millilitre.
Incuber à 37 degrés Celsius pendant 12 heures. Ensuite, utilisez un mini-kit plasmide commercial pour extraire l’ADN plasmide, selon les instructions du fabricant. Dans cette procédure, le clonage de gRNA d’assemblage de chaîne est employé pour générer rapidement des plasmides d’expression de gRNA.
Un résultat typique des RPC utilisés pour obtenir les pièces STAgR est vu ici. Les six amplicons représentent des morceaux d’ADN linéaires, chacun contenant les séquences individuelles de gRNA N20 à leurs extrémités. L’épine dorsale plasmide est étendue avec les séquences de ciblage de gRNA1 et gRNA6, et possède donc les chevauchements requis à deux autres PCR pour Gibson Assembly.
Après purification, un rendement d’ADN d’au moins un microgramme pour les vecteurs et les inserts peut être atteint. Après gibson assembly, la transformation bactérienne se traduit par 100 à 700 colonies bactériennes. L’analyse représentative de 22 colonies bactériennes, par l’intermédiaire du PCR de colonie suivant un protocole de STAgR avec six cassettes de gRNA, indique que sept clones montrent la taille amplicon prévue pour l’assemblage complet.
Les autres clones ont probablement reçu des vecteurs STAgR, contenant une à cinq cassettes gRNA, alors qu’un clone est complètement vide. Une fois maîtrisée, cette technique peut se faire en quelques heures. Bien exécuté, il permet la génération d’une multitude de vecteurs d’expression de multiplex gRNA en moins d’une semaine de travail.
Tout en essayant cette procédure, il est important de prêter attention à l’attribution correcte et la combinaison d’amorces en surplomb N20. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension sur la façon de créer votre propre guide multiplexe vecteurs d’expression arn.
