Le protocole décrit ici fournit une méthode intégrative combinant des tests de microbiologie classiques avec l’imagerie vivante unicellulaire pour caractériser les cellules persistantes d’Escherichia coli après un traitement à haute teneur en ofloxacine. Le principal avantage de cette technique est d’analyser le phénomène de persistance au niveau de la population et de la cellule unique. La combinaison de l’analyse de population et de cellules uniques permet de caractériser moléculairement et cellulairement le phénotype de persistance.
Pour commencer, étalez la souche bactérienne d’intérêt à partir d’un stock de glycérol congelé sur une plaque de gélose LB et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit pendant une période de 15 à 19 heures pour obtenir des colonies uniques. Inoculer une colonie isolée dans un tube de verre contenant cinq millilitres de milieu de croissance MOPS supplémenté en glucose à 0,4% et, si nécessaire, ajouter un antibiotique sélectif dans le milieu. Placez le tube dans un incubateur à secousses à 37 degrés Celsius et 180 tr / min pendant la nuit.
Le lendemain, centrifuger un millilitre de culture à 2 300 g pendant trois minutes pour granuler les cellules, et remettre doucement la pastille en suspension avec le même volume de PBS. Mesurez la DO à 600 nanomètres et calculez le volume nécessaire pour un OD600 initial de 0,01 dans un volume final de deux millilitres. Ensuite, ajoutez deux millilitres de glycérol MOPS à 0,4% dans un puits d’une plaque à fond transparent de 24 puits et inoculez avec le volume de culture de nuit calculé.
Placez la plaque de 24 puits dans un lecteur de microplaques automatisé pour surveiller l’OD600 pendant 24 heures. Réglez le lecteur de microplaques pour mesurer l’OD600 toutes les 15 minutes à une température de 37 degrés Celsius et avec une rotation orbitale élevée de 140 tr/min. Faire fondre 100 millilitres de gélose LB et stocker le ballon à 55 degrés Celsius pour éviter la solidification.
Préparer six petites fioles en verre et pipeter cinq millilitres de gélose LB liquide dans chaque fiole à l’aide d’une pipette stérile. Prenez 10 microlitres de la solution mère d’ofloxacine de cinq milligrammes par millilitre et diluez dans 90 microlitres d’eau ultrapure. Ajouter des volumes croissants d’ofloxacine diluée à chacun des six flacons en verre contenant du milieu gélosé LB pour obtenir une concentration finale de zéro à 0,1 microgramme par millilitre d’ofloxacine.
Mélanger la solution en tournant les flacons plusieurs fois et verser le milieu de gélose LB ajouté aux antibiotiques dans une plaque de culture à six puits. Laisser la gélose refroidir jusqu’à solidification et sécher la plaque avant utilisation. Diluer une culture bactérienne pendant la nuit à une densité cellulaire finale d’une fois 10 à la septième UFC par millilitre avec du PBS.
Repérez deux microlitres de culture diluée sur chaque puits de la plaque séchée à six puits. Laissez sécher les taches avant de placer l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, vérifiez à quelle concentration d’ofloxacine la croissance des colonies bactériennes est inhibée.
Versez environ 25 millilitres de gélose LB préparée dans une boîte de Pétri. Ajoutez ensuite cinq à huit billes de verre stériles à chaque plaque solidifiée et séchée. Retourner et étiqueter les plaques.
Ensuite, préparez dix tubes en verre de dilution en série contenant 900 microlitres de solution de sulfate de magnésium 0,01 molaire. Dans un tube en verre, diluer une culture de nuit dans un milieu frais et ajusté en température jusqu’à obtenir un OD600 final d’environ 0,001 et laisser la culture pousser pendant la nuit dans un incubateur. Le lendemain, lorsque l’OD600 atteint 0,3, transférer 100 microlitres de la culture pour la dilution selon les données du test localisé.
Effectuer une dilution en série décuplée de la culture bactérienne. Plaquez ensuite 100 microlitres de la culture diluée sur les plaques de gélose LB préparées. Ajouter la concentration désirée d’ofloxacine dans la culture bactérienne et continuer à incuber à 37 degrés Celsius tout en agitant.
Aux moments pertinents, prélever 100 microlitres de la culture et diluer la culture en fonction des données de l’essai localisé. Plaque 100 microlitres de la culture diluée sur les plaques de gélose LB. Le lendemain, compter les colonies des plaques incubées pendant la nuit aux deux dilutions les plus élevées pour lesquelles des colonies peuvent être détectées.
Calculer le taux de survie en normalisant l’UFC par millilitre à chaque point temporel à l’UFC par millilitre à T0, et tracer la valeur normalisée de la base logarithmique 10 en fonction du temps. Retirer la solution de conservation de chaque puits de la plaque microfluidique et la remplacer par un milieu de culture frais. Scellez la plaque microfluidique avec le système collecteur en cliquant sur le bouton Seal ou via le logiciel microfluidique.
Ensuite, sur l’interface microfluidique du logiciel, effectuez une première séquence d’amorçage en cliquant sur Run Liquid Priming Sequence. Incuber la plaque dans une armoire thermostatique du microscope à 37 degrés Celsius pendant au moins deux heures avant de commencer l’imagerie microscopique. Commencez ensuite une deuxième séquence d’amorçage liquide avant de commencer l’expérience.
Scellez la plaque microfluidique en cliquant sur Unseal Plate (Désscellé la plaque) sur l’interface du logiciel microfluidique. Remplacer le milieu dans les puits par 200 microlitres de milieu frais, contenant un antibiotique, et 0,01 OD d’échantillon de culture dilué dans le milieu frais. Après avoir scellé la plaque microfluidique comme démontré précédemment, placez la plaque sur l’objectif du microscope à l’intérieur de l’armoire de microscope.
Dans le logiciel microfluidique, cliquez sur la séquence de chargement de la cellule d’exécution pour permettre le chargement des cellules dans la plaque microfluidique. Réglez une mise au point optimale à l’aide du mode de lumière transmise et sélectionnez plusieurs régions d’intérêt où un nombre de cellules approprié allant jusqu’à 300 cellules par champ peut être observé. Sur le logiciel microfluidique, éditez le Run a Custom Sequence pour programmer l’injection de milieu frais à 6,9 kilopascals pendant six heures aux puits un et deux, suivi du milieu contenant un antibiotique à 6,9 kilopascals ou six heures au puits trois, et enfin du milieu frais à 6,9 kilopascals pendant 24 heures aux puits quatre et cinq.
Effectuez l’imagerie microscopique en mode time-lapse avec une image toutes les 15 minutes en utilisant la lumière transmise et la source lumineuse d’excitation pour le rapporteur fluorescent, et démarrez le programme microfluidique. Ouvrez le logiciel ImageJ ou Fiji sur l’ordinateur et faites glisser les images de microscopie time-lapse hyperstack dans la barre de chargement Fiji. Utilisez Image, puis Couleur, puis Créer un composite pour fusionner les différents canaux de l’hyperpile.
Utilisez Image, Couleur, puis Réorganiser les couches si les couches ne correspondent pas à la couleur souhaitée. Ouvrez le plugin MicrobeJ et détectez les cellules bactériennes à l’aide de l’interface d’édition manuelle. Supprimez les cellules détectées automatiquement et délimitez manuellement les cellules persistantes d’intérêt image par image.
Après la détection, utilisez l’icône Résultat dans l’interface d’édition manuelle MicrobeJ pour générer une table ResultJ. Utilisez la table ResultJ pour obtenir des informations sur les différents paramètres d’intérêt de l’analyse unicellulaire et enregistrez le fichier ResultJ. La CMI de l’ofloxacine pour les deux souches a été déterminée à 0,06 microgramme par millilitre, ce qui indique que la fusion hupA-mCherry n’a pas affecté la sensibilité de l’ofloxacine par rapport à la souche isogénique de type sauvage.
L’essai ponctuel a montré des clones isolés à des dilutions appropriées au fil du temps, par exemple 10 à la cinquième dilution négative au temps zéro. Dans le test time-kill, une courbe biphasique typique a été observée où la première pente reflète la mise à mort rapide de la population non persistante. La deuxième phase a montré un taux de destruction plus lent, révélant la présence de cellules persistantes tolérantes aux médicaments.
Notamment, la courbe time-kill montre que la protéine de fusion hupA-mCherry n’a pas affecté la cinétique time-kill. Dans l’expérience microfluidique, la première phase de croissance indique que les cellules étaient viables et se divisent avant le traitement à l’ofloxacine. Après cette première phase de croissance, la division cellulaire a été bloquée dès que l’antibiotique a atteint les cellules.
Après le traitement à l’ofloxacine, lors de la perfusion avec un milieu frais, la grande majorité des cellules ont été incapables de reprendre leur croissance. En revanche, une petite sous-population pourrait s’allonger et générer des cellules filamenteuses, qui sont définies comme les cellules persistantes. Le filament persistant en division a généré plusieurs cellules filles, dont la plupart ont commencé à croître et à se diviser de la même manière que les cellules non traitées.
L’augmentation de la longueur des cellules est corrélée à une augmentation de l’intensité totale de fluorescence mCherry, ce qui reflète le redémarrage de la réplication et une augmentation de l’abondance des nucléoïdes. Lors de l’utilisation d’une souche contenant un rapporteur intracellulaire pour étudier la persistance, il est impérial que la présence du rapporteur n’interfère pas avec la croissance, la CMI et la destruction par rapport à une souche de type sauvage. La procédure décrite ici peut être appliquée à d’autres conditions et espèces bactériennes pour surveiller les réponses cellulaires aux environnements changeants ou aux stress.
En utilisant d’autres rapporteurs fluorescents dans une configuration identique, de nouvelles connaissances sur la physiologie des cellules persistantes peuvent être sondées.
