Alors que les températures mondiales continuent d’augmenter, la quantification des limites thermiques et la relation avec l’acclimatation et l’ontogenèse sont essentielles pour déterminer la vulnérabilité des espèces au réchauffement futur. Pour les organismes marins ayant un cycle biologique complexe, la détermination des limites thermiques peut être difficile sur le plan logistique. Ce protocole introduit une méthode à faible empreinte et facile à construire pour estimer les températures critiques des petits organismes planctoniques.
Bien que la méthode ait été développée pour le plancton de petite taille inférieure à un millimètre, elle peut être adoptée pour les organismes marins plus grands qui tiendraient dans des flacons à scintillation d’environ 50 millilitres de volume. Commencez par brancher le bandelette chauffante au rhéostat. Percez 60 trous dans une grille de six par 10 pour préparer le bloc d’aluminium d’une taille de 20,3 par 15,2 par cinq centimètres, et assurez-vous que les trous sont espacés de deux centimètres du centre au centre dans les deux sens.
Percez deux trous supplémentaires entre la première et la deuxième colonne et les neuvième et 10e colonnes, correspondant à la taille des sondes du régulateur de température. Pour maintenir les éléments en place et isoler le bloc chauffant terminé, construisez un boîtier à partir de feuilles d’acrylique transparentes, en veillant à appliquer deux couches à l’arrière de l’élément chauffant. Dans l’assemblage final, appliquez de la pâte thermique pour maximiser la conductance thermique de l’élément chauffant dans le bloc et du bloc à l’élément de refroidissement.
Connectez le bain-marie avec le tube Tygon et insérez la sonde du thermostat dans les trous sur le côté du bloc d’aluminium. Dans tous les trous fraisés, placez des tubes microcentrifugeuses de 1,5 millilitre, remplis d’eau du robinet à ras bord. Allumez le régulateur de température et réglez la température d’arrêt de chauffage de la sonde un à 35 à 37 degrés Celsius et de la sonde deux à 21,5 à 22,5 degrés Celsius.
Faites pivoter le rhéostat pour allumer l’élément chauffant et réglez-le à moyen. Allumez le bain-marie et réglez la température du refroidisseur à 15 degrés Celsius. À l’aide d’un thermocouple avec une électrode de type K, vérifiez la température à l’intérieur de chaque tube de microcentrifugation toutes les 10 minutes par la suite.
Ajustez les valeurs des points de terminaison en modifiant les paramètres du régulateur de température et du bain-marie selon vos besoins. Allumez le bain-marie et le chauffage à recirculation et réglez-les à 15 degrés Celsius et 37 degrés Celsius respectivement, pour générer un gradient de température de 19,5 degrés Celsius à 37 degrés Celsius. Une fois que les tubes de microcentrifugeuses sont placés dans des trous fraisés et que la température du bloc thermique est atteinte, vérifiez la température à l’intérieur de chaque tube de microcentrifugation à l’aide d’un thermocouple avec une électrode de type K.
Et notez ces températures. Remplissez un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre avec de l’eau de mer, filtré à travers un maillage de 0,45 micromètre. Concentrer la culture de l’organisme à l’étude avec filtrage inverse afin que les organismes restent au fond du bécher.
Rincer la culture concentrée avec de l’eau de mer filtrée et répéter la filtration inversée une fois de plus pour concentrer l’échantillon. Compter les petits organismes planctoniques au microscope à dissection et transférer un nombre connu d’organismes dans des tubes microcentrifugeuses à moitié remplis à l’aide d’une pipette pasteur en verre. Maintenant, ajoutez de l’eau de mer filtrée jusqu’à ce que le volume final dans ces tubes atteigne un millilitre.
Maintenant, placez ces tubes par paires dans le bloc chauffant, en commençant par l’extrémité froide pour permettre aux organismes de se réchauffer progressivement à la température expérimentale souhaitée. Attendez 10 minutes et déplacez les paires de tubes microcentrifuges vers les trous percés adjacents avec des températures plus chaudes. Placez des paires supplémentaires de tubes microcentrifugeuses dans chaque rangée à l’extrémité froide et continuez à les déplacer vers l’extrémité plus chaude par paires.
Une fois le bloc entier rempli, incuberez-le pendant deux heures à la température désignée. À la fin de la période d’incubation, mesurez la température dans chaque tube et notez-la. Transférez ensuite tous les tubes dans les supports pré-étiquetés et incuberez-les à une température prédéterminée pendant une heure pour permettre la récupération.
Pour dénombrer la partie de l’organisme vivant, transférer le contenu d’un tube microcentrifuge individuel dans une boîte de Pétri de 35 millimètres à l’aide d’une pipette en verre. Sous un microscope à dissection, comptez les organismes vivants et morts et notez les nombres. Le nombre d’organismes observés doit correspondre à l’organisme prélevé à l’origine.
Si ce n’est pas le cas, vérifiez le côté des tubes microcentrifugeuses et de la boîte de Pétri, générez un tableau de données au format CSV avec les en-têtes regroupant la variable d’intérêt, la température du tube en degrés Celsius, le nombre d’individus vivants et le nombre d’individus morts. Pour ajuster les données avec une régression logistique, utilisez un modèle linéaire généralisé avec une distribution binomiale. Pour exécuter le modèle, tapez source et utilisez le fichier R, modelloop.r.
Calculez les valeurs prédictives auxquelles 50% des individus ont survécu, afin de déterminer la limite thermique supérieure médiane. À l’aide de ce protocole, la survie des larves de dollars de sable a été mesurée, qui était sur une plage de température de 19 à 37 degrés Celsius, deux, quatre et six jours après la fécondation. Au fur et à mesure que les larves de sable se développaient, la limite thermique supérieure est passée de 28,6 degrés Celsius deux jours après la fécondation à 28,8 degrés Celsius quatre jours après la fécondation et à environ 29 degrés Celsius six jours après la fécondation.
Les temps d’incubation et de récupération sont spécifiques à l’espèce. Il est important d’effectuer un test préliminaire pour s’assurer que le moment choisi donne une estimation fiable de la vie par rapport à la mort.
