Küresel sıcaklıklar artmaya devam ettikçe, termal sınırların ve iklimlendirme ve ontojeni ile olan ilişkinin ölçülmesi, türlerin gelecekteki ısınmaya karşı savunmasızlığını belirlemek için hayati öneme sahiptir. Karmaşık yaşam öyküleri olan deniz organizmaları için, termal sınırların belirlenmesi lojistik olarak zor olabilir. Bu protokol, küçük planktonik organizmaların kritik sıcaklıklarını tahmin etmek için küçük bir ayak izi, oluşturulması kolay bir yöntem sunar.
Yöntem, milimetreden daha küçük boyutlu bir plankton için geliştirilmiş olsa da, yaklaşık 50 mililitre hacimli parıltı şişelerine sığacak daha büyük deniz organizmaları için benimsenebilir. Şerit ısıtıcıyı reostata bağlayarak başlayın. 20,3 x 15,2 x beş santimetre boyutundaki alüminyum bloğu hazırlamak için altı x 10 boyutunda bir ızgarada 60 delik açın ve deliklerin her iki yönde de merkezden merkeze iki santimetre aralıklı olduğundan emin olun.
Birinci ve ikinci kolon ile dokuzuncu ve 10. kolon arasında, sıcaklık kontrol cihazı problarının boyutuna uyan iki ek delik açın. Elemanları yerinde tutmak ve tamamlanan ısı bloğunu yalıtmak için, ısıtma elemanının arka tarafına iki katman uygulanmasını sağlayarak şeffaf akrilik levhalardan bir kasa oluşturun. Son montajda, ısıtma elemanından bloğa ve bloktan soğutma elemanına ısı iletkenliğini en üst düzeye çıkarmak için termal macun uygulayın.
Su banyosunu Tygon borusu ile bağlayın ve termostat probunu alüminyum bloğun yanındaki deliklere yerleştirin. Tüm frezelenmiş deliklere, ağzına kadar musluk suyuyla doldurulmuş 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpleri yerleştirin. Sıcaklık kontrol cihazını açın ve probun durma ısıtma sıcaklığını bir ila 35 ila 37 santigrat derece ve probu iki ila 21,5 ila 22,5 santigrat derece olarak ayarlayın.
Isıtma elemanını açmak için reostat döndürün ve ortasına ayarlayın. Su banyosunu açın ve soğutucu sıcaklığını 15 santigrat dereceye ayarlayın. K-tipi elektrotlu bir termokupl kullanarak, her 10 dakikada bir her bir mikro santrifüj tüpünün içindeki sıcaklığı kontrol edin.
Sıcaklık kontrol cihazının ve su banyosunun ayarlarını gerektiği gibi değiştirerek uç noktaların değerlerini ayarlayın. Devridaim yapan su banyosunu ve ısıtıcıyı açın ve 19,5 santigrat dereceden 37 santigrat dereceye kadar bir sıcaklık gradyanı oluşturmak için sırasıyla 15 santigrat derece ve 37 santigrat dereceye ayarlayın. Mikro santrifüj tüpleri frezelenmiş deliklere yerleştirildikten ve ısı bloğunun sıcaklığına ulaşıldıktan sonra, K-tipi elektrotlu bir termokupl kullanarak her bir mikro santrifüj tüpünün içindeki sıcaklığı kontrol edin.
Ve bu sıcaklıkları not edin. 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünü, 0,45 mikrometrelik bir ağdan süzülmüş deniz suyuyla doldurun. Çalışma organizmasının kültürünü ters filtreleme ile yoğunlaştırın, böylece organizmalar kabın dibinde kalır.
Konsantre kültürü filtrelenmiş deniz suyuyla durulayın ve numuneyi konsantre etmek için ters filtrelemeyi bir kez daha tekrarlayın. Küçük planktonik organizmaları diseksiyon mikroskobu altında sayın ve bilinen sayıda organizmayı bir cam pastörlü pipet kullanarak yarı dolu mikro santrifüj tüplerine aktarın. Şimdi bu tüplerdeki son hacim bir mililitreye ulaşana kadar filtrelenmiş deniz suyu ekleyin.
Şimdi bu tüpleri, organizmaların yavaş yavaş istenen deneysel sıcaklığa ısınmasına izin vermek için soğuk uçtan başlayarak ısıtma bloğuna çiftler halinde yerleştirin. 10 dakika bekleyin ve mikro santrifüj tüp çiftlerini daha sıcak sıcaklıklara sahip bitişik delinmiş deliklere taşıyın. Soğuk uçtaki her sıraya ek mikro santrifüj tüp çiftleri yerleştirin ve bunları çiftler halinde daha sıcak uca doğru kaydırmaya devam edin.
Tüm blok doldurulduktan sonra, belirlenen sıcaklıkta iki saat boyunca inkübe edin. Kuluçka süresinin sonunda, her tüpteki sıcaklığı ölçün ve not edin. Daha sonra tüm tüpleri önceden etiketlenmiş tutuculara aktarın ve iyileşmeye izin vermek için bir saat boyunca önceden belirlenmiş bir sıcaklıkta inkübe edin.
Canlı organizma kısmını numaralandırmak için, ayrı bir mikro santrifüj tüpünün içeriğini bir cam pipet kullanarak 35 milimetrelik bir petri kabına aktarın. Diseksiyon yapan bir mikroskop altında, canlı ve ölü organizmaları sayın ve sayıları not edin. Gözlemlenen organizma sayısı, orijinal olarak alınan organizma ile eşleşmelidir.
Değilse, mikro santrifüj tüplerinin ve petri kabının yan tarafını kontrol edin, İlgilenilen değişkeni gruplandıran başlıklarla CSV formatında bir veri tablosu oluşturun, tüpün santigrat derece cinsinden sıcaklığı, yaşayan bireylerin sayısı ve ölen bireylerin sayısı. Verileri lojistik regresyonla sığdırmak için, binom dağılımına sahip genelleştirilmiş bir doğrusal model kullanın. Modeli çalıştırmak için source yazın ve modelloop.r R dosyasını kullanın.
Medyan üst termal sınırı belirlemek için bireylerin% 50'sinin hayatta kaldığı öngörücü değerleri hesaplayın. Bu protokolü kullanarak, larva kum dolarlarının hayatta kalması, döllenmeden iki, dört ve altı gün sonra, 19 ila 37 santigrat derece sıcaklık aralığında ölçüldü. Larva kumu dolarları geliştikçe, üst termal sınır döllenmeden sonraki iki günde 28.6 santigrat dereceden, döllenmeden sonraki dört günde 28.8 santigrat dereceye ve döllenmeden altı gün sonra yaklaşık 29 santigrat dereceye yükselmiştir.
Kuluçka ve iyileşme süreleri türlere özgüdür. Seçilen zamanlamanın güvenilir bir canlı ve ölü tahmini sağladığından emin olmak için bir ön test yapmak önemlidir.
