Поскольку глобальные температуры продолжают расти, количественная оценка тепловых пределов и взаимосвязи с акклиматизацией и онтогенезом имеют жизненно важное значение для определения уязвимости видов к будущему потеплению. Для морских организмов со сложной историей жизни определение тепловых пределов может быть логистически сложной задачей. Этот протокол вводит небольшой, простой в построении метод оценки критических температур небольших планктонных организмов.
В то время как метод был разработан для небольшого планктона размером менее миллиметра, он может быть принят для более крупных морских организмов, которые поместились бы в сцинтилляционные флаконы объемом около 50 миллилитров. Начните с подключения полосового нагревателя к реостату. Просверлите 60 отверстий в сетке размером шесть на 10, чтобы подготовить алюминиевый блок размером 20,3 на 15,2 на пять сантиметров, и убедитесь, что отверстия расположены на два сантиметра от центра к центру в обоих направлениях.
Просверлите два дополнительных отверстия между первой и второй колоннами и девятой и 10-й колоннами, соответствующие размеру датчиков регулятора температуры. Чтобы удержать элементы на месте и изолировать готовый тепловой блок, соорудите корпус из прозрачных акриловых листов, обеспечив нанесение двух слоев на заднюю сторону нагревательного элемента. В окончательной сборке нанесите термопасту для максимизации теплопроводности от нагревательного элемента в блок и от блока к охлаждающему элементу.
Соедините водяную баню с трубкой Tygon и вставьте датчик термостата в отверстия на боковой стороне алюминиевого блока. Во всех фрезерованных отверстиях поместите 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки, заполненные водопроводной водой до краев. Включите регулятор температуры и установите температуру остановки нагрева зонда один до 35 до 37 градусов Цельсия, а зонда два до 21,5 до 22,5 градусов Цельсия.
Поверните реостат, чтобы включить нагревательный элемент и установить его на средний. Включите водяную баню и установите температуру чиллера до 15 градусов по Цельсию. Используя термопару с электродом K-типа, проверяйте температуру внутри каждой микроцентрифужной трубки каждые 10 минут после этого.
Отрегулируйте значения конечных точек, изменяя настройки регулятора температуры и водяной бани по мере необходимости. Включите рециркуляционную водяную баню и нагреватель и установите их на 15 градусов Цельсия и 37 градусов Цельсия соответственно, чтобы создать градиент температуры от 19,5 градусов Цельсия до 37 градусов Цельсия. После того, как микроцентрифужные трубки помещены в фрезерованные отверстия и температура теплового блока достигнута, проверьте температуру внутри каждой микроцентрифужной трубки с помощью термопары с электродом K-типа.
И запишите эти температуры. Наполните 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку морской водой, отфильтрованной через сетку 0,45 микрометра. Сконцентрируйте культуру исследуемого организма с обратной фильтрацией так, чтобы организмы оставались на дне стакана.
Промыть концентрированную культуру фильтрованной морской водой и повторить обратную фильтрацию еще раз, чтобы сконцентрировать образец. Подсчитайте мелкие планктонные организмы под рассекающим микроскопом и переведите известное количество организмов в наполовину заполненные микроцентрифужные трубки с помощью стеклянной пастерной пипетки. Теперь добавляем фильтрованную морскую воду до тех пор, пока конечный объем в этих трубках не достигнет одного миллилитра.
Теперь поместите эти трубки парами в нагревательный блок, начиная с холодного конца, чтобы позволить организмам постепенно нагреваться до желаемой экспериментальной температуры. Подождите 10 минут и переместите пары микроцентрифужных трубок в соседние просверленные отверстия с более высокими температурами. Поместите дополнительные пары микроцентрифужных трубок в каждый ряд на холодном конце и продолжайте смещать их к более теплому концу парами.
После того, как весь блок заполнен, высиживайте его в течение двух часов при заданной температуре. В конце инкубационного периода измерьте температуру в каждой трубке и запишите ее. Затем переложите все пробирки на предварительно маркированные держатели и инкубируйте их при заданной температуре в течение одного часа, чтобы обеспечить восстановление.
Для перечисления живой части организма перенесите содержимое отдельной микроцентрифужной трубки в 35-миллиметровую чашку Петри с помощью стеклянной пипетки. Под рассекающим микроскопом подсчитайте живые и мертвые организмы и запишите цифры. Наблюдаемое количество организмов должно соответствовать первоначально взятому организму.
Если это не так, проверьте сторону микроцентрифужных трубок и чашки Петри, сгенерируйте таблицу данных в формате CSV с заголовками, группирующими интересующую переменную, температуру трубки в градусах Цельсия, количество живых особей и количество погибших особей. Чтобы сопоставить данные с логистической регрессией, используйте обобщенную линейную модель с биномиальным распределением. Чтобы запустить модель, введите source и используйте файл R modelloop.r.
Вычислите значения предикторов, при которых выжили 50% особей, чтобы определить медианный верхний тепловой предел. Используя этот протокол, была измерена выживаемость личиночных песочных долларов, которая находилась в диапазоне температур от 19 до 37 градусов по Цельсию через два, четыре и шесть дней после оплодотворения. По мере развития личиночного песка верхний тепловой предел увеличился с 28,6 градусов по Цельсию через два дня после удобрения до 28,8 градусов по Цельсию через четыре дня после удобрения и примерно до 29 градусов по Цельсию через шесть дней после удобрения.
Время инкубации и восстановления зависит от вида. Важно провести предварительный тест, чтобы убедиться, что выбранное время дает надежную оценку живого и мертвого.
