Poiché le temperature globali continuano ad aumentare, quantificare i limiti termici e la relazione con l'acclimatazione e l'ontogenesi sono vitali per determinare la vulnerabilità delle specie al riscaldamento futuro. Per gli organismi marini con storie di vita complesse, determinare i limiti termici può essere logisticamente impegnativo. Questo protocollo introduce un piccolo ingombro, un metodo facile da costruire per stimare le temperature critiche di piccoli organismi planctonici.
Mentre il metodo è stato sviluppato per plancton piccolo, di dimensioni inferiori a un millimetro, può essere adottato per organismi marini più grandi che si inserirebbero in fiale di scintillazione di circa 50 millilitri di volume. Inizia collegando il riscaldatore a strisce al reostato. Praticare 60 fori in una griglia di sei per 10 dimensioni per preparare il blocco di alluminio di una dimensione di 20,3 per 15,2 per cinque centimetri e assicurarsi che i fori siano distanziati di due centimetri dal centro al centro in entrambe le direzioni.
Praticare due fori aggiuntivi tra la prima e la seconda colonna e la nona e la 10a colonna, in base alle dimensioni delle sonde del regolatore di temperatura. Per mantenere gli elementi in posizione e isolare il blocco termico completato, costruire una custodia da fogli acrilici trasparenti, assicurandosi di applicare due strati sul retro dell'elemento riscaldante. Nell'assemblaggio finale, applicare la pasta termica per massimizzare la conduttanza termica dall'elemento riscaldante nel blocco e dal blocco all'elemento di raffreddamento.
Collegare il bagno d'acqua con tubi Tygon e inserire la sonda del termostato nei fori sul lato del blocco di alluminio. In tutti i fori fresati, posizionare tubi di micro-centrifuga da 1,5 millilitri, riempiti con acqua di rubinetto fino all'orlo. Accendere il regolatore di temperatura e impostare la temperatura di arresto del riscaldamento della sonda da uno a 35-37 gradi Celsius e la sonda da due a 21,5-22,5 gradi Celsius.
Ruotare il reostato per accendere l'elemento riscaldante e impostarlo su medio. Accendere il bagno d'acqua e impostare la temperatura del refrigeratore a 15 gradi Celsius. Utilizzando una termocoppia con un elettrodo di tipo K, controllare la temperatura all'interno di ogni tubo di microcentrifuga ogni 10 minuti successivi.
Regolare i valori dei punti finali modificando le impostazioni del regolatore di temperatura e del bagno d'acqua in base alle esigenze. Accendere il bagno d'acqua e il riscaldatore di ricircolo e impostarli rispettivamente su 15 gradi Celsius e 37 gradi Celsius, per generare un gradiente di temperatura da 19,5 gradi Celsius a 37 gradi Celsius. Una volta posizionati i tubi della microcentrifuga in fori fresati e raggiunta la temperatura del blocco termico, controllare la temperatura all'interno di ogni tubo di microcentrifuga utilizzando una termocoppia con elettrodo di tipo K.
E annota queste temperature. Riempire un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri con acqua di mare, filtrato attraverso una maglia da 0,45 micrometri. Concentrare la coltura dell'organismo in studio con il filtraggio inverso in modo che gli organismi rimangano sul fondo del becher
Risciacquare la coltura concentrata con acqua di mare filtrata e ripetere ancora una volta il filtraggio inverso per concentrare il campione. Contare i piccoli organismi planctonici al microscopio da dissezione e trasferire un numero noto di organismi in provette di microcentrifuga riempite a metà utilizzando una pipetta pasteur di vetro. Ora aggiungi acqua di mare filtrata fino a quando il volume finale in questi tubi raggiunge un millilitro.
Ora posiziona questi tubi a coppie nel blocco riscaldante, partendo dall'estremità fredda per consentire agli organismi di riscaldarsi gradualmente fino alla temperatura sperimentale desiderata. Attendere 10 minuti e spostare le coppie di tubi di microcentrifuga nei fori adiacenti con temperature più calde. Posizionare ulteriori coppie di tubi di microcentrifuga in ogni fila all'estremità fredda e continuare a spostarli verso l'estremità più calda a coppie.
Una volta riempito l'intero blocco, incubarlo per due ore alla temperatura designata. Alla fine del periodo di incubazione, misurare la temperatura in ciascun tubo e annotarla. Quindi trasferire tutti i tubi ai supporti pre-etichettati e incubarli a una temperatura predeterminata per un'ora per consentire il recupero.
Per enumerare la porzione di organismo vivo, trasferire il contenuto di una singola provetta di microcentrifuga in una capsula di Petri da 35 millimetri utilizzando una pipetta di vetro. Sotto un microscopio da dissezione, conta gli organismi vivi e morti e annota i numeri. Il numero osservato di organismi dovrebbe corrispondere all'organismo originariamente preso.
In caso contrario, controllare il lato dei tubi di micro-centrifuga e della capsula di Petri, Generare una tabella dati in formato CSV con le intestazioni che raggruppano la variabile di interesse, la temperatura del tubo in gradi Celsius, il numero di individui vivi e il numero di individui morti. Per adattare i dati a una regressione logistica, utilizzare un modello lineare generalizzato con una distribuzione binomiale. Per eseguire il modello, digitare source e utilizzare il file R, modelloop.r.
Calcolare i valori predittivi a cui il 50% degli individui è sopravvissuto, per determinare il limite termico superiore mediano. Utilizzando questo protocollo, è stata misurata la sopravvivenza dei dollari di sabbia larvale, che era in un intervallo di temperatura compreso tra 19 e 37 gradi Celsius, a due, quattro e sei giorni dopo la fecondazione. Con lo sviluppo dei dollari di sabbia larvale, il limite termico superiore è aumentato da 28,6 gradi Celsius a due giorni dopo la fecondazione, a 28,8 gradi Celsius a quattro giorni dopo la fecondazione e circa 29 gradi Celsius a sei giorni dopo la fecondazione.
I tempi di incubazione e recupero sono specifici della specie. È importante condurre un test preliminare per garantire che la tempistica selezionata produca una stima affidabile dal vivo rispetto ai morti.
