مع استمرار ارتفاع درجات الحرارة العالمية ، يعد تحديد الحدود الحرارية والعلاقة مع التأقلم والتطور أمرا حيويا لتحديد مدى تعرض الأنواع للاحترار في المستقبل. بالنسبة للكائنات البحرية ذات تاريخ الحياة المعقد ، يمكن أن يكون تحديد الحدود الحرارية أمرا صعبا من الناحية اللوجستية. يقدم هذا البروتوكول طريقة صغيرة الحجم وسهلة البناء لتقدير درجات الحرارة الحرجة للكائنات العوالق الصغيرة.
في حين تم تطوير هذه الطريقة للعوالق الصغيرة التي يقل حجمها عن ملليمتر ، يمكن اعتمادها للكائنات البحرية الأكبر حجما والتي تتناسب مع قوارير التلألؤ التي يبلغ حجمها حوالي 50 ملليلتر. ابدأ بتوصيل سخان الشريط بمقاومة متغيرة. حفر 60 حفرة في شبكة بحجم ستة في 10 لتحضير كتلة الألمنيوم بحجم 20.3 × 15.2 في خمسة سنتيمترات ، والتأكد من أن الثقوب متباعدة بسنتيمترين من المركز إلى المركز في كلا الاتجاهين.
قم بحفر فتحتين إضافيتين بين العمود الأول والثاني والعمود التاسع و 10 ، بما يتناسب مع حجم مجسات التحكم في درجة الحرارة. لتثبيت العناصر في مكانها وعزل الكتلة الحرارية المكتملة ، قم ببناء علبة من ألواح الأكريليك الشفافة ، مع ضمان تطبيق طبقتين في الجانب الخلفي من عنصر التسخين. في التجميع النهائي ، ضع معجون حراري لزيادة التوصيل الحراري من عنصر التسخين إلى الكتلة ومن الكتلة إلى عنصر التبريد.
قم بتوصيل الحمام المائي بأنابيب Tygon وأدخل مسبار الترموستات في الثقوب الموجودة على جانب كتلة الألومنيوم. في جميع الثقوب المطحونة ، ضع أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 ملليلتر ، مملوءة بماء الصنبور حتى أسنانها. قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة الحرارة واضبط درجة حرارة إيقاف التسخين للمسبار من واحد إلى 35 إلى 37 درجة مئوية ، ودقق من 21.5 إلى 22.5 درجة مئوية.
قم بتدوير مقاومة متغيرة لتشغيل عنصر التسخين واضبطه على متوسط. قم بتشغيل الحمام المائي واضبط درجة حرارة المبرد على 15 درجة مئوية. باستخدام مزدوج حراري مع قطب كهربائي من النوع K ، تحقق من درجة الحرارة داخل كل أنبوب طرد مركزي دقيق كل 10 دقائق بعد ذلك.
اضبط قيم نقاط النهاية عن طريق تغيير إعدادات وحدة التحكم في درجة الحرارة والحمام المائي حسب الحاجة. قم بتشغيل حمام الماء المعاد تدويره والسخان واضبطهما على 15 درجة مئوية و 37 درجة مئوية على التوالي ، لتوليد تدرج درجة الحرارة من 19.5 درجة مئوية إلى 37 درجة مئوية. بمجرد وضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في ثقوب مطحونة والوصول إلى درجة حرارة كتلة الحرارة ، تحقق من درجة الحرارة داخل كل أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام مزدوج حراري مع قطب كهربائي من النوع K.
ولاحظ درجات الحرارة هذه. املأ أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر بمياه البحر ، يتم ترشيحه من خلال شبكة 0.45 ميكرومتر. ركز ثقافة الكائن الحي الذي تمت دراسته بالترشيح العكسي بحيث تظل الكائنات الحية في قاع الكأس الزجاجية.
اشطف المزرعة المركزة بمياه البحر المفلترة ، وكرر الترشيح العكسي مرة أخرى لتركيز العينة. عد الكائنات العوالق الصغيرة تحت مجهر تشريح ونقل عدد معروف من الكائنات الحية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة نصف مملوءة باستخدام ماصة باستور زجاجية. أضف الآن مياه البحر المفلترة حتى يصل الحجم النهائي في هذه الأنابيب إلى ملليلتر واحد.
الآن ضع هذه الأنابيب في أزواج في كتلة التسخين ، بدءا من الطرف البارد للسماح للكائنات الحية بالإحماء تدريجيا إلى درجة الحرارة التجريبية المطلوبة. انتظر لمدة 10 دقائق وانقل أزواج أنابيب الطرد المركزي الدقيقة إلى الثقوب المحفورة المجاورة ذات درجات الحرارة الأكثر دفئا. ضع أزواجا إضافية من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في كل صف في الطرف البارد واستمر في تحويلها نحو الطرف الأكثر دفئا في أزواج.
بمجرد ملء الكتلة بأكملها ، احتضنها لمدة ساعتين عند درجة الحرارة المحددة. في نهاية فترة الحضانة ، قم بقياس درجة الحرارة في كل أنبوب وقم بتدوينها. ثم انقل جميع الأنابيب إلى الحوامل ذات العلامات المسبقة واحتضانها عند درجة حرارة محددة مسبقا لمدة ساعة واحدة للسماح بالاسترداد.
لتعداد جزء الكائن الحي ، انقل محتويات أنبوب طرد مركزي دقيق فردي في طبق بتري 35 ملم باستخدام ماصة زجاجية. تحت مجهر تشريح ، عد الكائنات الحية والميتة وقم بتدوين الأرقام. يجب أن يتطابق العدد المرصود من الكائنات الحية مع الكائن الحي المأخوذ في الأصل.
إذا لم يحدث ذلك ، فتحقق من جانب أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وطبق بتري ، وقم بإنشاء جدول بيانات بتنسيق CSV مع متغير تجميع الرؤوس محل الاهتمام ، ودرجة حرارة الأنبوب بالدرجات المئوية ، وعدد الأفراد على قيد الحياة ، وعدد الأفراد القتلى. لملاءمة البيانات مع الانحدار اللوجستي ، استخدم نموذجا خطيا معمما بتوزيع ذو حدين. لتشغيل النموذج، اكتب المصدر، واستخدم الملف R، modelloop.r.
احسب قيم المتنبئ التي نجا عندها 50٪ من الأفراد ، لتحديد الحد الحراري الأعلى المتوسط. باستخدام هذا البروتوكول ، تم قياس بقاء دولارات رمل اليرقات ، والتي كانت عبر نطاق درجة حرارة تتراوح من 19 إلى 37 درجة مئوية ، بعد يومين وأربعة وستة أيام من الإخصاب. ومع تطور دولارات رمال اليرقات، ارتفع الحد الحراري الأعلى من 28.6 درجة مئوية في يومين بعد الإخصاب، إلى 28.8 درجة مئوية في أربعة أيام بعد الإخصاب، وحوالي 29 درجة مئوية في ستة أيام بعد الإخصاب.
أوقات الحضانة والانتعاش خاصة بالأنواع. من المهم إجراء اختبار أولي للتأكد من أن التوقيت المختار ينتج عنه تقدير موثوق به للأحياء مقابل الموتى.
