地球の気温が上昇し続けるにつれて、熱限界と順応および個体発生との関係を定量化することは、将来の温暖化に対する種の脆弱性を決定するために不可欠です。複雑な生活史を持つ海洋生物にとって、熱限界を決定することはロジスティック的に困難な場合があります。このプロトコルは、小さな浮遊生物の臨界温度を推定するための小さなフットプリントで構築が容易な方法を導入しています。
この方法は、1ミリメートル未満のサイズの小さなプランクトン用に開発されましたが、約50ミリリットルの容量のシンチレーションバイアルに収まるより大きな海洋生物にも採用できます。ストリップヒーターをレオスタットに配線することから始めます。6 x 10サイズのグリッドに60個の穴を開けて、20.3 x 15.2 x 5センチメートルのサイズのアルミニウムブロックを準備し、穴が中心から中心まで両方向に2センチメートル間隔になるようにします。
温度調節器プローブのサイズに合わせて、1列目と2列目、9列目と10列目の間にさらに2つの穴を開けます。エレメントを所定の位置に保持し、完成したヒートブロックを断熱するには、透明なアクリルシートからケースを構築し、発熱体の裏側に2つの層を塗布します。最終アセンブリでは、サーマルペーストを塗布して、発熱体からブロックへ、およびブロックから冷却要素への熱伝導率を最大化します。
ウォーターバスをタイゴンチューブに接続し、サーモスタットプローブをアルミニウムブロックの側面の穴に挿入します。すべての粉砕穴に、水道水で満たされた1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブを縁まで置きます。温度コントローラーの電源を入れ、プローブ1の加熱停止温度を摂氏35〜37度に設定し、プローブ2の加熱温度を摂氏21.5〜22.5度に設定します。
レオスタットを回転させて発熱体をオンにし、中程度に設定します。ウォーターバスの電源を入れ、チラーの温度を摂氏15度に設定します。K型電極付きの熱電対を使用して、その後10分ごとに各マイクロ遠心管内の温度を確認します。
必要に応じて温度調節器とウォーターバスの設定を変更して、エンドポイントの値を調整します。循環水浴とヒーターの電源を入れ、それぞれ摂氏15度と摂氏37度に設定して、摂氏19.5度から摂氏37度の温度勾配を生成します。マイクロ遠心管をフライス穴に配置し、ヒートブロックの温度に達したら、K型電極を備えた熱電対を使用して各遠沈管内の温度を確認します。
そして、これらの温度を書き留めます。1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに海水を入れ、0.45マイクロメートルのメッシュでろ過します。生物がビーカーの底に残るように、逆フィルタリングで研究生物の培養物を濃縮します。
濃縮培養液をろ過した海水ですすぎ、もう一度逆ろ過を繰り返してサンプルを濃縮します。解剖顕微鏡で小さな浮遊生物を数え、ガラスパスツールピペットを使用して、既知の数の生物を半分満たされたマイクロ遠心チューブに移します。次に、これらのチューブの最終容量が1ミリリットルに達するまで、ろ過された海水を追加します。
次に、これらのチューブをコールドエンドから始めてペアで加熱ブロックに配置し、生物が徐々に目的の実験温度までウォームアップできるようにします。10分間待ってから、マイクロ遠心チューブのペアを、より暖かい温度の隣接するドリル穴に移動します。低温端の各列にマイクロ遠心チューブの追加ペアを配置し、ペアで暖かい端に向かってシフトし続けます。
ブロック全体がいっぱいになったら、指定された温度で2時間インキュベートします。インキュベーション期間の終わりに、各チューブの温度を測定し、それを書き留めます。次に、すべてのチューブを事前にラベル付けされたホルダーに移し、所定の温度で1時間インキュベートして回復させます。
生きている生物部分を列挙するために、個々の微小遠心チューブの内容物をガラスピペットを用いて35ミリメートルシャーレに移す。解剖顕微鏡の下で、生きている生物と死んだ生物を数え、数を書き留めます。観察された生物の数は、最初に撮影された生物と一致するはずです。
そうでない場合は、マイクロ遠心チューブとシャーレの側面を確認し、関心のあるヘッダーグループ化変数、摂氏温度のチューブの温度、生きている個人数、および死亡した個人数を含むCSV形式のデータテーブルを生成します。ロジスティック回帰でデータを適合させるには、二項分布を持つ一般化線型モデルを使用します。モデルを実行するには、「ソース」と入力し、R ファイル modelloop.r を使用します。
個人の50%が生存した予測変数の値を計算して、熱の上限の中央値を決定します。このプロトコルを使用して、受精後2、4、6日で、摂氏19〜37度の温度範囲にわたる幼虫の砂の生存率が測定されました。幼虫の砂のドルが発達するにつれて、体温の上限は受精後2日目の摂氏28.6度から、受精後4日目の摂氏28.8度、受精後6日目の摂氏約29度に増加しました。
潜伏時間と回復時間は種によって異なります。予備テストを実施して、選択したタイミングによって信頼できるライブ推定値とデッド推定値が得られることを確認することが重要です。
