Da die globalen Temperaturen weiter steigen, sind die Quantifizierung der thermischen Grenzen und die Beziehung zu Akklimatisierung und Ontogenese von entscheidender Bedeutung, um die Anfälligkeit von Arten für zukünftige Erwärmung zu bestimmen. Für Meeresorganismen mit komplexer Lebensgeschichte kann die Bestimmung thermischer Grenzen eine logistische Herausforderung darstellen. Dieses Protokoll führt eine einfache Methode mit geringem Platzbedarf ein, um kritische Temperaturen von kleinen Planktonorganismen abzuschätzen.
Während die Methode für kleines, weniger als einen Millimeter großes Plankton entwickelt wurde, kann sie für größere Meeresorganismen angewendet werden, die in Szintillationsfläschchen mit einem Volumen von etwa 50 Milliliter passen würden. Beginnen Sie mit der Verkabelung des Heizstreifens mit dem Rheostaten. Bohren Sie 60 Löcher in einem Raster von sechs mal 10 Größen, um den Aluminiumblock mit einer Größe von 20,3 x 15,2 mal fünf Zentimetern vorzubereiten, und stellen Sie sicher, dass die Löcher zwei Zentimeter von Mitte zu Mitte in beide Richtungen verteilt sind.
Bohren Sie zwei zusätzliche Löcher zwischen der ersten und zweiten Säule und der neunten und 10. Säule, die der Größe der Temperaturreglersonden entsprechen. Um die Elemente an Ort und Stelle zu halten und den fertigen Heizblock zu isolieren, konstruieren Sie ein Gehäuse aus klaren Acrylplatten und achten Sie darauf, zwei Schichten auf der Rückseite des Heizelements aufzutragen. Tragen Sie in der Endmontage Wärmeleitpaste auf, um die Wärmeleitfähigkeit vom Heizelement in den Block und vom Block zum Kühlelement zu maximieren.
Verbinden Sie das Wasserbad mit dem Tygon-Schlauch und führen Sie die Thermostatsonde in die Löcher an der Seite des Aluminiumblocks ein. In alle gefrästen Löcher 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen geben, die bis zum Rand mit Leitungswasser gefüllt sind. Schalten Sie den Temperaturregler ein und stellen Sie die Heiztemperatur von Sonde eins auf 35 bis 37 Grad Celsius und Sonde zwei auf 21,5 bis 22,5 Grad Celsius ein.
Drehen Sie den Rheostat, um das Heizelement einzuschalten, und stellen Sie es auf mittel. Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur des Kühlers auf 15 Grad Celsius ein. Überprüfen Sie anschließend mit einem Thermoelement mit einer K-Elektrode alle 10 Minuten die Temperatur in jedem Mikrozentrifugenröhrchen.
Passen Sie die Werte der Endpunkte an, indem Sie die Einstellungen des Temperaturreglers und des Wasserbades nach Bedarf ändern. Schalten Sie das Umlaufwasserbad und die Heizung ein und stellen Sie sie auf 15 Grad Celsius bzw. 37 Grad Celsius ein, um einen Temperaturgradienten von 19,5 Grad Celsius bis 37 Grad Celsius zu erzeugen. Sobald die Mikrozentrifugenröhrchen in gefräste Löcher gelegt wurden und die Temperatur des Wärmeblocks erreicht ist, überprüfen Sie die Temperatur in jedem Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Thermoelement mit einer Elektrode vom Typ K.
Und notieren Sie diese Temperaturen. Füllen Sie ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Meerwasser, gefiltert durch ein 0,45-Mikrometer-Netz. Konzentrieren Sie die Kultur des Studienorganismus mit umgekehrter Filterung, so dass die Organismen am Boden des Becherglases verbleiben.
Spülen Sie die konzentrierte Kultur mit gefiltertem Meerwasser und wiederholen Sie die Rückfilterung erneut, um die Probe zu konzentrieren. Zählen Sie die kleinen Planktonorganismen unter einem Seziermikroskop und überführen Sie eine bekannte Anzahl von Organismen mit einer Glaspasteurpipette in halbgefüllte Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie nun gefiltertes Meerwasser hinzu, bis das Endvolumen in diesen Röhrchen einen Milliliter erreicht.
Legen Sie nun diese Röhrchen paarweise in den Heizblock, beginnend mit dem kalten Ende, damit sich die Organismen allmählich auf die gewünschte Versuchstemperatur erwärmen können. Warten Sie 10 Minuten und bewegen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen zu den benachbarten Bohrlöchern mit wärmeren Temperaturen. Platzieren Sie zusätzliche Paare von Mikrozentrifugenröhrchen in jeder Reihe am kalten Ende und verschieben Sie sie paarweise zum wärmeren Ende.
Sobald der gesamte Block gefüllt ist, inkubieren Sie ihn für zwei Stunden bei der angegebenen Temperatur. Messen Sie am Ende der Inkubationszeit die Temperatur in jedem Röhrchen und notieren Sie sie. Dann werden alle Röhrchen in die vormarkierten Halter überführt und eine Stunde lang bei einer vorbestimmten Temperatur inkubiert, um eine Erholung zu ermöglichen.
Zur Zählung des Anteils des lebenden Organismus wird der Inhalt eines einzelnen Mikrozentrifugenröhrchens in eine 35-Millimeter-Petrischale mit einer Glaspipette überführt. Zählen Sie unter einem Seziermikroskop die lebenden und toten Organismen und notieren Sie die Zahlen. Die beobachtete Anzahl von Organismen sollte mit dem ursprünglich entnommenen Organismus übereinstimmen.
Wenn dies nicht der Fall ist, überprüfen Sie die Seite der Mikrozentrifugenröhrchen und der Petrischale, generieren Sie eine Datentabelle im CSV-Format mit den Kopfzeilen, die die interessierende Variable gruppieren, die Temperatur der Röhre in Grad Celsius, die Anzahl der lebenden Individuen und die Anzahl der toten Personen. Um die Daten mit einer logistischen Regression anzupassen, verwenden Sie ein verallgemeinertes lineares Modell mit einer Binomialverteilung. Geben Sie zum Ausführen des Modells source ein, und verwenden Sie die R-Datei modelloop.r.
Berechnen Sie die Prädiktorwerte, bei denen 50% der Individuen überlebten, um die mittlere obere thermische Grenze zu bestimmen. Mit diesem Protokoll wurde das Überleben von Larvensanddollars gemessen, das über einen Temperaturbereich von 19 bis 37 Grad Celsius lag, zwei, vier und sechs Tage nach der Befruchtung. Als sich Larvensanddollars entwickelten, stieg die obere thermische Grenze von 28,6 Grad Celsius zwei Tage nach der Befruchtung auf 28,8 Grad Celsius vier Tage nach der Befruchtung und etwa 29 Grad Celsius sechs Tage nach der Befruchtung.
Inkubations- und Erholungszeiten sind artspezifisch. Es ist wichtig, einen vorläufigen Test durchzuführen, um sicherzustellen, dass das ausgewählte Timing eine zuverlässige Live-tot-Schätzung liefert.
