Notre protocole fournit un milieu cocktail pour prolonger la durée de vie des neutrophiles à plus de cinq jours sans compromettre les fonctions des neutrophiles. Il offre également une dialyse in vitro fiable pour les neutrophiles. Le traitement par CLON-G élargit les possibilités de préservation, de transport et de manipulation génétique des neutrophiles, ce qui peut accélérer la recherche dans la communauté des neutrophiles.
Pour commencer, préparez le milieu de base en ajoutant RPMI 1640 FBS et stylo-streptocoque à un tube de 50 millilitres. Simultanément, décongelez toutes les solutions mères des composants CLON-G sur la glace. Diluer ensuite HSP 70 et 200 microgrammes par millilitre de G-CSF dans le milieu basique.
Transférer 976 microlitres de milieu basique dans un tube centrifuge de 15 millilitres. À cela, ajoutez les composants CLON-G pour préparer un millilitre de milieu CLON-G 2x comme décrit dans le manuscrit. Ensuite, préparez la culture des neutrophiles en suspendant les neutrophiles de souris isolés dans le milieu de base.
Ajouter le milieu CLON-G, suivi du milieu de base à 24 plaques de culture non tissulaire puits. Ajoutez ensuite 100 microlitres de la suspension cellulaire préparée et pipeter doucement trois à quatre fois. Incuber la plaque de culture à 37 degrés Celsius avec 5% d’apport de dioxyde de carbone.
Colorer les neutrophiles cultivés avec du cytospin et les analyser à l’aide d’un microscope optique. Pour l’analyse par cytométrie en flux, ajoutez un millilitre de milieu cellulaire à la culture cellulaire de neutrophiles cultivée pendant la nuit. Mélanger le milieu de culture cellulaire en le pipetant doucement cinq à sept fois et transférer 100 microlitres de ce mélange dans un tube de cytométrie en flux aux points de temps souhaités.
Simultanément, faire tourbillonner les billes de comptage et pipeter 10 microlitres de solution de billes sur le même tube de cytométrie en flux contenant le milieu cellulaire. Ajouter 10 microlitres d’un mélange de coloration pré-préparé à ce tube de cytométrie en flux et incuber pendant cinq minutes au réfrigérateur à la tombée de la nuit. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution saline dans le tube et mélangez bien pour une répartition uniforme des billes et des cellules de comptage.
Enfin, effectuez l’analyse de cytométrie en flux de la suspension cellulaire comme décrit dans le manuscrit du texte. Pour le dosage des images fluorescentes, ajoutez deux millilitres de suspension cellulaire par plaque confocale et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pendant ce temps, dissoudre un gramme de chlorure de calcium dans 45 millilitres de solution saline et filtrer-le avec une unité de filtration de 0,2 micromètre.
Retirez délicatement la plaque confocale au point de temps requis. Colorer les cellules avec 10 microlitres de FITC-Annexin-V, PI et chlorure de calcium pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, à l’aide d’un microscope confocale à fluorescence, capturez les images en utilisant les canaux souhaités.
Dans la présente étude, la morphologie des neutrophiles n’a pas été affectée dans le milieu CLON-G, même après cinq jours. De plus, les phénotypes de fax ont démontré des cellules intactes après le traitement. L’analyse par cytométrie en flux a montré une population positive de neutrophiles non traités dans l’annexine-V et la perte de population pourrait être due à l’acide éthylène diamine tétraacétique dans le milieu cellulaire.
Cependant, la viabilité des neutrophiles traités par CLON-G à 24 heures était d’environ plus de 90 %. Les tests d’image fluorescente ont également confirmé la viabilité cellulaire des neutrophiles traités par CLON-G. Les neutrophiles cultivés dans le milieu basique pendant 24 heures ont montré des cellules gonflées et la perte de ces cellules pourrait avoir résulté de l’agitation ou du pipetage de la plaque confocale. Les concentrations et les effets des composés CLON-G peuvent avoir un impact significatif sur les tests de neutrophiles.
Dans la mesure du possible, évitez de les moduler. Les recherches sur les neutrophiles sont laborieuses, coûteuses et extrêmement limitées dans leur application clinique en raison de leur courte durée de vie. Cette méthode permet de surmonter partiellement ces obstacles.
