Les outils d’édition du génome basés sur CRISPR ont grandement facilité la production de modèles de représentation génétiquement modifiés. Le système CRISPR est composé d’un seul complexe d’ARN guide vers une nucléase Cas9 et peut être programmé pour cibler une séquence d’intérêt dans le génome afin de créer une cassure de l’ADN double brin. Grâce à la colivraison d’un modèle de réparation de l’ADN, cette cassure de l’ADN peut être restaurée avec précision ainsi que l’ajout de n’importe quelle séquence d’ADN modifiée souhaitée grâce à un processus appelé réparation dirigée par homologie.
C’est par ce processus que nous sommes en mesure de générer des modèles de rats knock-in avec des insertions ou des substitutions d’ADN ciblées. À l’aide de ce protocole, nous présentons une approche modifiée utilisant un virus adéno-associé pour fournir un modèle de réparation de l’ADN à des embryons de rat, ainsi qu’une livraison ultérieure de complexes CRISPR Cas9 par électroporation d’embryons à deux cellules. Les sérotypes AAV 1 ou 6 sont emballés avec un modèle de réparation de l’ADN conçu pour être intégré dans le génome du rat par le biais du processus de réparation dirigée par homologie médiée par CRISPR.
L’AAV est ajouté à une goutte de 30 microlitres de milieu KSOM de rat à une concentration finale de 3 X 10 à 7 copies du génome par microlitre. Ensuite, des embryons d’une cellule fraîchement prélevés avec des pronoyaux visibles sont ensuite transférés dans le milieu contenant de l’AAV, ce qui permet la transduction virale. En utilisant notre protocole, il n’est pas nécessaire d’amincir la zone pellucide, car les sérotypes AAV 1 et 6 sont capables de passer facilement à travers pour une livraison efficace de la matrice de réparation de l’ADN.
Les embryons sont cultivés avec l’AAV pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et une humidité maximale. Le lendemain, on réalise un mélange d’électroporation contenant une centaine de nanogrammes par microlitre d’ARN guide unique et une centaine de nanogrammes par microlitre de protéine Cas9 diluée dans un milieu OptiMIM. Le mélange est incubé à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre la formation de complexes CRISPR RNP.
Pendant le temps d’incubation, l’électroporateur est allumé et des fils sont fixés aux électrodes à lame de verre. Une fois la formation de RNP terminée, cinq microlitres de mélange d’électroporation sont pipetés entre les électrodes, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air dans la solution. Les embryons, maintenant au stade de deux cellules, sont retirés du milieu contenant de l’AAV et soigneusement déplacés vers le mélange d’électroporation entre les électrodes.
Les embryons sont alignés, en veillant à ce qu’aucun ne touche l’une ou l’autre des électrodes, car cela provoquerait une lyse pendant l’électroporation. Voici une vue de cette procédure à travers le microscope. Il est également important de noter que l’impédance diminue à mesure que le volume entre les électrodes augmente.
Pour cette raison, et afin de ne pas diluer le mélange d’électroporation, un minimum de milieux doit être transféré avec les embryons. Ensuite, l’impédance est mesurée en appuyant sur le bouton avec un symbole ohm dessus. L’impédance doit être comprise entre 0,18 et 0,3 ohms.
S’il est à portée, l’électroporation est démarrée en appuyant sur le bouton de démarrage. Ce processus ne prend que quelques secondes, et voici à quoi il ressemble au microscope. Vous remarquerez que des bulles se forment rapidement sur chaque électrode.
Immédiatement après l’électroporation, les embryons sont prélevés sur la lame de verre et lavés trois fois dans un milieu KSOM de rat frais. Les embryons peuvent ensuite être cultivés pour des études in vitro ou transférés à des femelles porteuses pour produire une progéniture vivante. Il est important de noter que le gonflement de l’embryon est fréquent après l’électroporation.
Ce gonflement devrait s’atténuer après quelques heures de culture. Il est également fréquent de voir des événements de fusion cellulaire dans jusqu’à 20% des embryons de deux cellules après l’électroporation. La fusion cellulaire peut généralement être évitée par un alignement minutieux de l’axe horizontal des embryons entre les électrodes.
Tester notre protocole sur des embryons de rat et cribler des blastes cultivés pour l’insertion d’une courte séquence d’intron artificiel contenant deux sites loxP. Nous avons noté que plus de 60 % des blastocystes contiennent l’allèle knock-in correctement ciblé sur la base d’une analyse de séquence de nouvelle génération. Ensuite, en testant davantage notre protocole pour produire des rats knock-in vivants, nous concevons un projet visant à concevoir une séquence d’enrobage de la recombinase Cre ciblant le site de départ ATG du gène DRD2 du rat.
Sur les 11 enfants nés, 10 étaient positifs par analyse PCR dans le bras à cinq homologies principales, à trois bras d’homologie principale et à un test PCR interne pour détecter la recombinase de la Cre. En résumé, sur sept projets différents, nous avons atteint un taux de réussite moyen de 76 % chez les animaux fondateurs, tel que déterminé par l’analyse PCR des jonctions de bras d’homologie et la vérification de la séquence d’ADN. En utilisant cette livraison d’ADN médiée par AAV et ce pipeline d’électroporation d’embryons à deux cellules, nous avons constaté des efficacités de frappe significativement plus élevées que les approches traditionnelles pour les insertions d’ADN d’une longueur maximale de trois Ko.
Il est également important de noter que, bien que nous ayons démontré l’utilisation de cette procédure chez les embryons de rats, elle peut également être appliquée efficacement à d’autres espèces pour générer des insertions d’ADN ciblées.
