RK et RRG ont été soutenus par une subvention du Centre des métaux en biologie et en médecine (CMBM) de l’UNM par le biais de la subvention P20 P20 GM130422 du NIH NIH. RRG a été soutenu par une subvention pilote de la subvention NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. Le soutien de l’imagerie pour l’instrument CX7 Cellomics a été fourni par les cœurs du centre AIM financés par la subvention NIH P20GM121176. Nous tenons à remercier le Dr Sharina Desai et le Dr Li Chen pour leur aide précieuse concernant les problèmes techniques liés à l’utilisation de la plate-forme d’imagerie CX7 Cellomics.

1. Culture cellulaire
<ol><li>Ensemencer les cellules d’essai (cellules de carcinome hépatocellulaire HepG2, HUH7 et JHH4) dans une plaque de 96 puits à une densité d’ensemencement de 10 000 cellules/puits dans un volume d’ensemencement final de 200 μL par puits.<ol><li>Avant de cultiver les cellules HepG2, enduire les 96 puits de plaques de collagène de type IV (50 μg/mL) pendant 2 h à température ambiante (RT). Pour éviter la solidification du collagène stock, placez la solution mère dans de la glace et par la suite, lancez le processus de dilution à la concentration souhaitée.</li>
		<li>Après une période d’incubation de 2 heures, aspirez l’excès de collagène et lavez les puits trois fois avec le 1x PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultivez les cellules dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) pendant la nuit à 37 °C et à une concentration de 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.</li>
	<li>Le lendemain, ou lorsque la confluence de 80 % à 90 % est atteinte, selon la première éventualité, traiter les cellules avec du H2O2 (non traité, 250 μM, 500 μM, 750 μM et 1000 μM) et de la ménadione (non traitée, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM), respectivement pendant 30 min pour induire le stress oxydatif représentatif.</li>
	<li>Vous pouvez également choisir de tester les cellules avec la substance de test de votre choix, capable d’induire un stress oxydatif dans les cellules.</li>
</ol>2. Préparation de solution mère et diluée pour la coloration DHE des cellules
<ol><li>Préparez une solution mère de DHE (5 mg/mL ou 15,9 mM) en dissolvant 5 mg de DHE dans 1 mL de DMSO.</li>
	<li>Diluer la solution mère de DHE avec de l’eau autoclavée doublement distillée jusqu’à une concentration finale de 100 μM.</li>
	<li>Pour éviter le processus de congélation et de décongélation du colorant (qui peut endommager les propriétés de fluorescence au fil du temps), préparer plusieurs aliquotes dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL avec une concentration de 100 μM et les conserver à -20 °C.</li>
	<li>Pour obtenir une concentration de travail finale de 10 μM, utilisez une aliquote de la concentration de DHE de 100 μM et diluez-la avec un média DMEM préchauffé. REMARQUE : La solution de travail doit être préparée fraîche le jour de l’expérience.</li>
	<li>Vortex la solution de colorant de fluorescence de travail pendant 5 à 10 s pour assurer un bon mélange du colorant.</li>
</ol>3. Processus de coloration DHE
<ol><li>Retirez le milieu contenant le médicament ou la substance d’essai de chaque puits et lavez-le doucement une fois avec 1x PBS ou DMEM. REMARQUE : Lors de l’exécution des étapes d’ajout ou de lavage de l’expérience, il est crucial d’éviter tout contact direct entre les cellules et le pipeteur. Cela peut être réalisé en pipetant doucement le PBS le long des côtés des puits pour minimiser tout dommage mécanique potentiel aux cellules. S’assurer que la pipette ne touche pas directement les cellules aidera à maintenir l’intégrité et la viabilité des cellules pendant toute la durée de l’expérience.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de milieu DMEM contenant 10 μM de DHE (solution de travail) dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Après une période d’incubation de 30 minutes, retirez le milieu contenant de la DHE et lavez chaque puits doucement trois fois avec la solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Cela peut être effectué avec une pipette multicanal pour assurer un délai d’exécution rapide.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de 1x PBS dans chaque puits avec le colorant de coloration nucléaire Hoechst 33342 pendant 10 min à RT.</li>
	<li>Retirez la solution de coloration nucléaire Hoechst 33342 du puits et ajoutez 200 μL de 1x PBS dans chaque puits. REMARQUE : Pour obtenir des cellules fixes, suivez le même protocole que pour les cellules vivantes, avec une étape supplémentaire consistant à ajouter 4 % de PFA pendant 5 minutes après le traitement et la coloration à la DHE. Retirez la solution PFA et lavez les cellules avec le 1x PBS. Ensuite, incubez les cellules avec le colorant nucléaire pendant 10 min.</li>
	<li>Déplacez la plaque vers la plate-forme de criblage à haut contenu, la microscopie à fluorescence ou le lecteur de plaques pour l’acquisition d’images le plus rapidement possible.</li>
</ol>4. Acquisition d’images et mesure d’intensité
<ol><li>Chargement des plaques<ol><li>Ouvrez le logiciel de criblage à haut contenu (HCS) Cellomics CX7 pour l’acquisition de données.</li>
		<li>Calibrez soigneusement la plate-forme d’imagerie selon les spécifications du fabricant à l’avance avec la plaque spécifique à 96 puits de votre choix pour éviter toute image floue ou floue dans les données. REMARQUE : Les plaques multipuits de différents fournisseurs peuvent avoir des propriétés de matériau différentes et peuvent influencer la qualité des images finales obtenues.</li>
		<li>Une fois étalonnés, enregistrez les paramètres du système spécifiques à la marque de la plaque dans la base de données de l’instrument et réutilisez-les pour de futures acquisitions de données.</li>
		<li>Placez soigneusement la plaque contenant les échantillons préparés sur la platine chauffée du système d’imagerie HCS. Assurez-vous que la plaque est bien positionnée et dans la bonne orientation pour l’imagerie sur le support de microplaque (c’est-à-dire localisez l’étiquette marquée A1 sur la platine du lecteur, puis faites pivoter la microplaque de manière à ce que l’emplacement du puits A1 corresponde au coin avec l’autocollant).</li>
		<li>Appuyez doucement sur la microplaque pour vous assurer qu’elle repose à plat contre la platine. Un nivellement inégal de la plaque dans le système HCS peut entraîner des erreurs d’acquisition d’images.</li>
		<li>Une fois la plaque en place, maintenez la touche Ctrl enfoncée, puis cliquez sur Ctrl-OK dans la boîte de dialogue Charger/Décharger la plaque du logiciel.</li>
	</ol></li>
	<li>Sélection des paramètres d’imagerie<ol><li>Dans le système d’imagerie HCS, ouvrez le mode d’activation de la cible dans l’interface des bio-applications Cellomics et créez un nouveau protocole à l’aide du protocole de configuration à deux canaux compatible avec (a) la coloration nucléaire et (b) l’acquisition de données de sonde de fluorescence DHE. Dans le protocole actuel, les filtres 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS et 386_BGS_RS ont été utilisés pour (a) la coloration nucléaire Hoechst 33342, (b) la production totale de ROS et (c) la détection des radicaux superoxydes, respectivement. Le choix de ces filtres a été motivé par le chevauchement spécifique des propriétés d’émission de chaque colorant (DAPI et DHE) utilisé dans le cadre de ce protocole. REMARQUE : La convention de dénomination des filtres, par exemple 386-23_BGRFRN_BGRFRN, fait référence à l’excitation de l’échantillon avec une lumière de 386 nm avec une largeur de bande de 23 nm, suivie d’un filtre dichroïque qui laisse passer la lumière bleue (B), verte (G), rouge (R), rouge lointaine (FR) et proche infrarouge (N) à des gammes de longueurs d’onde spécifiques et le 386_BGS_RS fait référence à un filtre d’émission qui laisse passer la lumière de longueur d’onde d’émission BGS et RS après le dichroïque.</li>
		<li>Spécifiez les objectifs du processus d’acquisition d’images dans l’interface du protocole logiciel, tels que le grossissement 10x ou 20x, selon les besoins.</li>
		<li>Choisissez le grossissement d’objectif approprié en fonction du niveau de détail d’imagerie souhaité et des résolutions nécessaires à l’expérience. Cependant, la résolution de chaque objectif est fixe. Des détails de résolution plus élevés nécessiteront de changer l’objectif sur la plate-forme. Dans le protocole actuel, un objectif 20x, 0,45 NA est utilisé, qui fait partie de la plate-forme de criblage à haut contenu utilisée dans ce protocole. REMARQUE : L’objectif 20x représente un bon compromis entre les détails de la résolution d’image et la vitesse d’acquisition nécessaire pour capturer les changements ROS au fil du temps. Des objectifs à grossissement plus élevé peuvent être choisis (par exemple, 40X), mais cela entraînera des temps d’acquisition plus longs.</li>
		<li>Spécifiez les paramètres d’exposition de la caméra d’acquisition d’images, tels que le temps d’exposition, le binning de la caméra et l’intervalle z-stack, en fonction des exigences spécifiques du protocole. REMARQUE : Le temps d’exposition (souvent en millisecondes) varie en fonction de la force du signal et de la sensibilité des fluorophores spécifiques utilisés. Cela peut également différer légèrement d’une expérience à l’autre en fonction de la concentration de colorant et de la qualité de la coloration. Dans le protocole actuel, les paramètres d’acquisition sont fixés comme suit : % cible - 35 %, mode d’acquisition d’image - 1104 x 1104 (avec binning 2x2) et objectif 20x, 0,45 NA. Ces paramètres peuvent être réglés en fonction des conditions expérimentales spécifiques.</li>
	</ol></li>
	<li>Paramètres de configuration de l’imagerie REMARQUE : Une fois les paramètres d’imagerie définis, le processus de collecte d’images peut être lancé à l’aide de l’interface logicielle.<ol><li>Paramètres de collecte d’images<ol><li>Identifier l’objet d’intérêt principal (le noyau des cellules) à l’aide de différents algorithmes disponibles dans l’instrument (optique - isodonnées, fixe et triangle). NOTA : La méthode isodonnée pour l’identification et le marquage de l’objet primaire est utilisée dans le présent protocole.</li>
			<li>Segmentez l’objet (le cas échéant) par forme ou par paramètre d’intensité.</li>
			<li>Validez l’objet principal en fonction des paramètres de taille, de forme et d’intensité souhaités propres à chaque type de cellule.</li>
			<li>Ensuite, définissez la « région d’intérêt » (ROI) autour de cet objet principal. REMARQUE : Le retour sur investissement est un paramètre clé de l’acquisition de données qui définit l’emplacement où l’intensité du colorant de fluorescence est identifiée comme étant cohérente et reproductible pour tous les types de cellules. Le retour sur investissement définit les paramètres clés (tels que l’intensité du colorant), qui sont mesurés pour chaque objet de suivi primaire (c’est-à-dire une cellule) dans différents canaux de l’instrument. Le retour sur investissement peut être défini sous la forme d’un cercle ou d’un anneau autour du noyau de chaque cellule. Le logiciel HCS obtient automatiquement l’intensité du marqueur de colorant de fluorescence DHE dans le canal 2 dans la limite du ROI pour chaque cellule segmentée et analysée de manière automatisée.</li>
			<li>Placez un cercle de 20 μm autour de l’objet principal (noyau). La distance de 20 μm a été choisie dans cette étude en fonction de la taille approximative des différentes lignées cellulaires utilisées dans ce protocole (HepG2, JHH-4 et HUH-7). Le retour sur investissement de l’anneau de 20 μm autour des cellules a obtenu l’intensité de fluorescence de manière cohérente et reproductible. REMARQUE : Le paramètre clé dans le choix d’un retour sur investissement est la capacité à couvrir correctement la zone de la cellule ; la taille du retour sur investissement circulaire dépend de la taille de la cellule. Les cellules plus grandes peuvent nécessiter un retour sur investissement plus important et vice-versa pour un retour sur investissement plus petit. Ces paramètres doivent être déterminés à l’avance pour chaque type de cellule et de colorant de fluorescence d’intérêt.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Caractérisation de la population et sélection des caractéristiques à stocker<ol><li>Une fois les différents paramètres d’acquisition définis dans le protocole d’imagerie HCS, mettez le système HCS en mode d’acquisition de données.</li>
		<li>Les paramètres d’acquisition d’images pour ce protocole ont été définis comme suit : une limite de balayage de 1000 cellules/puits, avec un minimum requis de 10 objets (cellules) par trame. REMARQUE : Le nombre de champs évalués pour chaque puits a été déterminé en fonction du nombre final de cellules atteignant le nombre de 1000. Le système HCS continue de rechercher divers endroits dans le puits jusqu’à ce qu’il obtienne la population cible de 1000 cellules/puits. La vitesse d’acquisition dépend donc de la confluence et du nombre total de cellules présentes dans chaque puits de la plaque de 96 puits. Dans le protocole actuel, l’intensité totale et moyenne du canal 2 (représentant les radicaux superoxydes et la production totale de ROS) a été collectée dans chaque puits pour des analyses ultérieures en aval.</li>
	</ol></li>
	<li>Capture, traitement et analyse d’images<ol><li>Après avoir ajusté et finalisé les paramètres d’acquisition d’image, lancez le processus de balayage pour chaque plaque à 96 puits. REMARQUE : Le système d’imagerie Cellomics CX7 permet un criblage à haut contenu et une analyse automatisée d’échantillons de divers paramètres, y compris la production de ROS dans les cellules à haut débit. En plus de la production de ROS, le système HCS est capable de fournir des informations supplémentaires précieuses sur divers paramètres tels que la morphologie cellulaire, la localisation subcellulaire et de nombreuses autres caractéristiques cellulaires d’intérêt. Une fois optimisée pour l’acquisition, la plateforme d’imagerie HCS permet une caractérisation complète, qualitative et quantitative des paramètres cellulaires de manière robuste.</li>
		<li>Une fois le processus de numérisation terminé, lancez le logiciel d’analyse de vue et exportez les différents paramètres de données quantitatives dans un format .csv pour une analyse supplémentaire.</li>
		<li>À l’aide d’un logiciel tiers, copiez et collez les différentes valeurs quantitatives d’intérêt pour des analyses supplémentaires en aval. REMARQUE : Dans le protocole actuel, le logiciel GraphPad Prism a été utilisé pour analyser les valeurs d’intensité de la DHE en réponse au stress oxydatif induit par les expositions à H2O2 et à la ménadione.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse des données et des statistiques<ol><li>Calculer l’intensité moyenne moyenne du canal 2 (représentant les valeurs ROS totales et les radicaux superoxydes). REMARQUE : Toutes les expériences pour calculer les valeurs d’intensité ont été répétées trois fois avec 6 répétitions par condition à chaque niveau de dosage.</li>
		<li>Effectuez une ANOVA unifacteur ou un test t pour mesurer les différences dans les valeurs d’intensité entre diverses conditions de test.</li>
	</ol></li>
</ol>

Nouvelle quantification des ROS à l’aide de dihydroéthidium dans des cellules cancéreuses du foie

<ol>
	<li>Juan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+of+reactive+oxygen+species+(ros)+revisited:+Outlining+their+role+in+biological+macromolecules+(DNA,+Lipids+and+Proteins)+and+induced+pathologies.">The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies.</a> Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).</li><li>Magnani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanisms+of+ROS+generation+by+NADPH+oxidases.">Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases.</a> Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).</li><li>Collin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+basis+of+reactive+oxygen+species+reactivity+and+involvement+in+neurodegenerative+diseases.">Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases.</a> Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).</li><li>Uttara, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+neurodegenerative+diseases:+a+review+of+upstream+and+downstream+antioxidant+therapeutic+options.">Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options.</a> Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).</li><li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+paramagnetic+resonance+measurements+of+reactive+oxygen+species+by+cyclic+hydroxylamine+spin+probes.">Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes.</a> Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+mitochondrial+ROS+in+AMPK+knockout+mice+blood+vessels.">Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels.</a> Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).</li><li>Griendling, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+reactive+oxygen+species,+reactive+nitrogen+species,+and+redox-dependent+signaling+in+the+cardiovascular+system:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).</li><li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Gomes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species.">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li><li>Halliwell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Free radicals in biology and medicine. , (2015).</li><li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+detection+and+quantification+of+features+of+cellular+senescence.">Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence.</a> Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).</li><li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+detection+of+superoxide+radical+anion+and+hydrogen+peroxide:+Opportunities,+challenges,+and+implications+in+redox+signaling.">Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling.</a> Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).</li><li>Robinson, K. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+specific+measurements+of+superoxide+using+fluorescence+spectroscopy.">Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy.</a> J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).</li><li>Murphy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+measuring+reactive+oxygen+species+and+oxidative+damage+in+cells+and+in+vivo.">Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo.</a> Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).</li><li>Ameziane-El-Hassani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+reactive+oxygen+species+in+cells+undergoing+oncogene-induced+senescence.">Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence.</a> Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).</li><li>Abraham, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+applied+to+large-scale+cell+biology.">High content screening applied to large-scale cell biology.</a> Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).</li><li>Criddle, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menadione-induced+reactive+oxygen+species+generation+via+redox+cycling+promotes+apoptosis+of+murine+pancreatic+acinar+cells.">Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells.</a> J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).</li><li>Goffart, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+and+source+of+reactive+oxygen+species+influences+the+outcome+of+oxidative+stress+in+cultured+cells.">The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells.</a> Cells. 10 (5), 1075 (2021).</li><li>Kurutas, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+antioxidants+which+play+the+role+in+cellular+response+against+oxidative/nitrosative+stress:+current+state.">The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state.</a> Nutr J. 15 (1), 71 (2015).</li><li>Shad, K. F., Das, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introductory+Chapter:+Role+of+Fenton+and+Haber-Weiss+Reaction+in+Epilepsy.">Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy.</a> Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Dans cette étude, un protocole permettant d’évaluer la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires induites par les superoxydes à l’aide d’un colorant de fluorescence dihydroéthidium (DHE) a été établi sur un système de criblage à haut contenu. La majorité des protocoles actuels disponibles dans la littérature utilisent le DCFH-DA comme sonde d’imagerie de fluorescence pour quantifier les espèces de ROS. Cependant, de nombreuses études ont montré que le DCFH-DA n’est ...

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont un groupe de radicaux chimiques naturels, hautement réactifs et instables dans le temps, formés dans le cadre du métabolisme cellulaire normal dans les cellules. Les ROS jouent un rôle clé et essentiel dans la modulation des processus physiologiques et biochimiques normaux qui se produisent dans les cellules 1,2. La principale source de production de ROS dans les cellules provient de la chaîne de transport d’électrons mitochondriale (CTE) dans le cadre du cycle bioénergétique normal. Les réactions enzymatiques telles que les NADPH oxydases cellulaires dans les cellules constituent d’autres sources importantes de production de ROS. Le métabolisme des molécules alimentaires (par exemple, le glucose) se produit via la voie de phosphorylation oxydative dans la matrice mitochondriale. Un niveau de base de production de ROS est essentiel pour réguler les processus physiologiques normaux de signalisation cellulaire. De nombreuses molécules protéiques clés qui font partie des voies de signalisation métabolique du glucose (par exemple, Akt et PTEN) sont connues pour répondre aux niveaux de ROS intracellulaires. De plus, les ROS sont produits par diverses enzymes intracellulaires telles que la xanthine oxydase, l’oxyde nitrique synthase et les constituants peroxysomaux dans le cadre des voies enzymatiques cellulaires 1,2. Contrairement aux sources naturelles de ROS, certains facteurs environnementaux, tels que les xénobiotiques, les agents infectieux, les rayons UV, la pollution, le tabagisme et les radiations, entraînent également une production excessive de ROS, qui sont un facteur clé du stress oxydatif intracellulaire 1,3. Un stress oxydatif cellulaire élevé peut endommager les biomolécules natives à l’intérieur d’une cellule, telles que les lipides, les protéines et l’ADN, provoquant diverses maladies telles que le cancer, le diabète, les maladies cardiovasculaires, l’inflammation chronique et les troubles neurodégénératifs 1,3,4. Par conséquent, des mesures précises des ROS sont essentielles pour comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans la physiopathologie des maladies induites par le stress oxydatif.
En raison des courtes échelles de temps de production et d’élimination des ROS à l’intérieur des cellules, les mesures quantitatives de divers radicaux ROS restent un défi. Des méthodes telles que la résonance paramagnétique électronique (EPR)5, la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) et l’imagerie par sonde de fluorescence sont utilisées pour mesurer les différents ROS cellulaires6. Bien que des méthodes telles que l’EPR et la HPLC donnent des estimations quantitativement précises, ces méthodes impliquent la destruction de la morphologie spatiale cellulaire et se présentent généralement sous la forme de mesures globales et globales d’un échantillon. En revanche, les méthodes basées sur l’imagerie telles que les méthodes basées sur des sondes de fluorescence conservent la morphologie cellulaire et le contexte spatial de la génération de ROS. Cependant, la spécificité de diverses sondes de fluorescence pour différents types de radicaux ROS n’a pas été bien établie 7,8. Plusieurs sondes fluorescentes telles que le dihydroéthidium (DHE), le diacétate de dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA), la dihydrorhodamine (DHR), le diméthylanthracène (DMA), la 2,7 dichlorodihydroflurescéine (DCFH), le 1,3-diphénylisobenzofurane (DPBF) et MitoSox sont disponibles dans le commerce pour la détection des ROS. Au cours des dernières décennies, DHE, MitoSox et DCFH-DA sont les colorants fluorescents couramment utilisés pour mesurer les ROS dans les cellules et les tissus 8,9. DCFH-DA est un colorant largement utilisé pour détecter le H2O2 intracellulaire et le stress oxydatif. Malgré la popularité du DCFH-DA, de nombreuses études antérieures ont montré qu’il ne peut pas être utilisé de manière fiable pour mesurer les niveaux intracellulaires de H2O2 et d’autres niveaux de ROS 8,9,10,11,12,13,14.
En revanche, la sonde fluorescente dihydroéthidium (DHE) montre une réponse spécifique au radical superoxyde intracellulaire (O2-). Bien que le radical superoxyde soit l’une des nombreuses espèces de ROS observées dans les cellules, c’est un radical important impliqué dans la réduction des métaux de transition, la conversion en peroxynitrate et la formation d’hydroperoxydes, entre autres effets intracellulaires. La DHE est rapidement absorbée par les cellules et a une émission de fluorescence dans la gamme de longueurs d’onde rouges15. En réagissant spécifiquement avec le radical superoxyde, la DHE forme un produit fluorescent rouge, le 2-hydroxy éthidium (2-OH-E+). Ainsi, la DHE peut être considérée comme une sonde spécifique pour la détection des superoxydes. Cependant, la DHE peut également subir une oxydation non spécifique avec ONOO- ou OH., H2O2 et cytochrome c pour former un deuxième produit de fluorescence, l’éthidium E+, qui peut interférer avec les niveaux mesurés de 2-OH-E+. Cependant, ces produits 2-OH E+ et E+, en combinaison, représentent une partie importante des espèces de ROS cellulaires totales observées à l’intérieur d’une cellule lorsqu’elles sont colorées à la DHE. E+ s’intercale dans l’ADN, améliorant considérablement sa fluorescence 8,9,10,11,13,14,15,16. Étant donné que les spectres de fluorescence de l’éthidium et du 2-hydroxy éthidium ne diffèrent que légèrement, la majorité des niveaux de ROS observés dans une cellule secondaire à la production de superoxyde peuvent être détectés et mesurés à l’aide de produits de fluorescence DHE. Ces espèces de ROS sont identifiées à l’aide d’une excitation de longueur d’onde de 480 nm et d’une émission de longueur d’onde de 610 nm 15,16,17.
En plus de choisir une sonde de détection de ROS fluorescente spécifique, il est important de choisir une méthode de détection sensible pour mesurer les ROS intracellulaires. Une évaluation précise des niveaux de ROS intracellulaires est donc essentielle pour identifier les états d’équilibre redox perturbés qui se produisent dans les cellules malades ou les cellules qui ont été exposées à divers facteurs de stress environnementaux tels que les radiations, les composés toxicologiques et les agents génotoxiques18. Étant donné que les ROS sont un phénomène courant dans les cellules qui est responsable de la régulation d’une variété d’activités de signalisation cellulaire, des méthodes robustes de détection des ROS sont essentielles. Pour permettre une telle évaluation à haut débit de la production de ROS dans les cellules, ce protocole utilise une plateforme de criblage à haut contenu (HCS) pour mesurer les espèces de ROS. Le protocole actuel permet l’analyse à haut débit de la production intracellulaire de ROS, ce qui est d’une importance cruciale dans de nombreuses études toxicologiques19. Ce protocole vise à fournir une solution simple et polyvalente pour détecter et mesurer les ROS intracellulaires dans les cellules de carcinome hépatocellulaire adhérent. Les réactifs chimiques deH2,O2 et de ménadione sont utilisés comme puissants stimulateurs de ROS pour mesurer les niveaux relatifs de production de ROS dans un environnement contrôlé et à haut débit. Ce protocole peut être affiné pour mesurer la production de ROS dans les cellules adhérentes et non adhérentes dans des conditions appropriées, si nécessaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>20170-038&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96- well plate&#160;</td>
			<td>Corning Costar&#160;</td>
			<td>07-200-90&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellomics Cx7</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>HCSDCX7LEDPRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen&#160;</td>
			<td>Advanced Biomatrix&#160;&#160;</td>
			<td>5056&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHE (Dihydroethidium)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>D1168&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;&#160;</td>
			<td>6046&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>97068-085&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>33342&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUH7 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>88597&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JHH4 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>M5625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput screening assessment of reactive oxygen species (ros) generation using dihydroethidium (dhe) fluorescence dye

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) jouent un rôle clé dans la régulation du métabolisme cellulaire dans les processus physiologiques et pathologiques. La production physiologique de ROS joue un rôle central dans la modulation spatiale et temporelle des fonctions cellulaires normales telles que la prolifération, la signalisation, l’apoptose et la sénescence. En revanche, la surproduction chronique de ROS est responsable d’un large éventail de maladies, telles que le cancer, les maladies cardiovasculaires et le diabète, entre autres. La quantification des niveaux de ROS de manière précise et reproductible est donc essentielle pour comprendre la fonctionnalité cellulaire normale. Les méthodes basées sur l’imagerie de fluorescence pour caractériser les espèces de ROS intracellulaires sont une approche courante. De nombreux protocoles ROS d’imagerie dans la littérature utilisent un colorant au diacétate de 2'-7'-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA). Cependant, ce colorant souffre de limitations importantes dans son utilisation et son interprétabilité. Le protocole actuel démontre l’utilisation d’une sonde fluorescente au dihydroéthidium (DHE) comme méthode alternative pour quantifier la production totale de ROS dans un environnement à haut débit. La plate-forme d’imagerie à haut débit, CX7 Cellomics, a été utilisée pour mesurer et quantifier la production de ROS. Cette étude a été menée sur trois lignées cellulaires de cancer hépatocellulaire - HepG2, JHH4 et HUH-7. Ce protocole fournit une description détaillée des différentes procédures impliquées dans l’évaluation des ROS dans les cellules, y compris la préparation de la solution de DHE, l’incubation des cellules avec une solution de DHE et la mesure de l’intensité de la DHE nécessaire pour caractériser la production de ROS. Ce protocole démontre que le colorant fluorescent DHE est un choix robuste et reproductible pour caractériser la production de ROS intracellulaires à haut débit. Les approches à haut débit pour mesurer la production de ROS sont susceptibles d’être utiles dans diverses études, telles que la toxicologie, le dépistage de médicaments et la biologie du cancer.

Reactive oxygen species (ROS) are a group of naturally occurring, highly reactive, and temporally unstable chemical radicals formed as a part of the normal cellular metabolism in&#160;cells. ROS plays a key and essential role in the modulation of normal physiological and biochemical processes occurring in cells1,2. The main source of ROS production in cells is from the mitochondrial electron transport chain (ETC) pathway as a part of the normal bioenergetic cycle. Significant additional sources of ROS production include enzymatic reactions such as cellular NADPH oxidases in cells. Metabolism of food molecules (e.g., glucose) occurs via the oxidative phosphorylation pathway in the mitochondrial matrix. A baseline level of ROS production is essential to regulate normal physiological cell signaling processes. Many key protein molecules that are part of the glucose metabolic signaling pathways (e.g., Akt and PTEN) are known to respond to intracellular ROS levels. Additionally, ROS are produced by various intracellular enzymes such as xanthine oxidase, nitric oxide synthase, and peroxisomal constituents as a part of the cellular enzymatic pathways1,2. In contrast to the natural sources of ROS, certain environmental factors, such as xenobiotics, infectious agents, UV light, pollution, cigarette smoking, and radiation, also lead to excessive production of ROS, which are a key driver of intra-cellular oxidative stress1,3. Elevated cellular oxidative stress can cause damage to native biomolecules inside a cell, such as lipids, proteins, and DNA, causing various diseases such as cancer, diabetes, cardiovascular disease, chronic inflammation, and neurodegenerative disorders1,3,4. Therefore, accurate measurements of ROS are essential to understand&#160;the cellular mechanisms involved in oxidative stress-induced disease pathophysiology.
Due to the short timescales of ROS production and elimination inside cells, quantitative measurements of various ROS radicals remains a challenge. Methods such as electron paramagnetic resonance (EPR)5, high-pressure liquid chromatography (HPLC), and fluorescence probe-based imaging are used to measure the various cellular ROS6. While methods such as EPR and HPLC yield quantitatively accurate estimates, these methods involve the destruction of the cellular spatial morphology and are usually in the form of global and bulk measurements of a sample. In contrast, imaging-based methods such as fluorescence probe-based methods retain the cellular morphology and spatial context of the ROS generation. However, the specificity of various fluorescence probes for different types of ROS radicals has not been well-established7,8. Several fluorescent probes such as dihydroethidium (DHE), dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), dihydrorhodamine (DHR), dimethyl anthracene (DMA), 2,7 dichlorodihydroflurescein (DCFH), 1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF), and MitoSox are available for ROS detection commercially. In the past decades, DHE, MitoSox, and DCFH-DA are the commonly used fluorescent dyes to measure ROS in cells and tissues8,9. DCFH-DA is a widely used dye for detecting intracellular H2O2 and oxidative stress. Despite the popularity of DCFH-DA, multiple previous studies have shown that it cannot be reliably used to measure intracellular H2O2 and other ROS levels8,9,10,11,12,13,14.
In contrast, the fluorescent probe dihydroethidium (DHE) shows a specific response to the intra-cellular superoxide radical (O2-). While the superoxide radical is one of many of the ROS species observed in cells, it is an important radical involved in the reduction of transition metals, conversion to peroxynitrate, and formation of hydroperoxides, among other intracellular effects. DHE is quickly taken up by the cells and has a fluorescence emission in the red wavelength range15. Upon reaction with superoxide radical specifically, DHE forms a red fluorescent product, 2-hydroxy ethidium (2-OH-E+). Thus, DHE may be considered as a specific probe for superoxide detection. However, DHE can also undergo nonspecific oxidation with ONOO- or OH., H2O2, and cytochrome c to form a second fluorescence product, ethidium E+, which can interfere with the measured 2-OH-E+ levels. However, these 2-OH E+ and E+ products, in combination, represent a major part of the total cellular ROS species observed inside a cell when stained with DHE. E+ intercalates into DNA, greatly enhancing its fluorescence8,9,10,11,13,14,15,16. Since the fluorescence spectra of ethidium and 2-hydroxy ethidium only differ slightly, the majority of ROS levels seen in a cell secondary to superoxide production can be detected and measured using DHE fluorescence products. These ROS species are identified using 480 nm wavelength excitation and 610 nm wavelength emission15,16,17.
In addition to choosing a specific fluorescent ROS detection probe, it is important to choose a sensitive method of detection to measure intracellular ROS. Accurate assessment of intracellular ROS levels is thus key to identifying disturbed redox balance states occurring in diseased cells or cells that have been exposed to various environmental stressors such as radiation, toxicological compounds, and genotoxic agents18. Since ROS is a commonly occurring phenomenon in cells that is responsible for regulating a variety of cell signaling activities, robust methods of detection of ROS are essential. To enable such high-throughput evaluation of ROS production within cells, this protocol uses a high-content screening (HCS) platform to measure the ROS species. The current protocol allows the high-throughput analysis of intracellular ROS production, which is of critical importance in many toxicology studies19. This protocol aims to provide an easy and versatile solution to detect and measure intracellular ROS in adherent hepatocellular carcinoma cells. The chemical reagents of H2O2 and menadione are used as potent ROS stimulators to measure the relative levels of ROS production in a controlled and high throughput setting. This protocol may be fine-tuned to measure ROS production in adherent and nonadherent cells under appropriate conditions, as necessary.

Pleins feux sur l’auteur : Mesure à haut débit des niveaux de ROS intracellulaires dans les lignées hépatocellulaires

Évaluation préalable à haut débit de la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) à l’aide d’un colorant de fluorescence à base de dihydroéthidium (DHE)

Our lab studies the impact of environmental pollutants, like heavy metals, on liver function and diseases related to reactive oxygen species production. This protocol aims to quantitatively measure ROS levels in cells using a dihydroethidium fluorescence probe. This protocol uses a high-content screening platform to quantitatively measure intracellular ROS species levels in hepatocellular lines.Measuring intercellular ROS level accurately is of critical importance in high-throughput toxicology study, which is a key area of interest in our lab. DHE fluorescence is a highly specific method for measuring total ROS levels, particularly targeting the superoxide radical, are giving it a significant advantage over other commonly used ROS fluorescence probe. Additionally, this protocol offer the unique ability to measure total cellular ROS level in a high-throughput platform.Our protocol is a robust and reproducible choice to characterize intracellular total ROS production. High-throughput approaches to measure ROS levels are helpful in a variety of studies, such as toxicology, drug screening, and cancer biology, which will be our focus in the future.

Le dihydroéthidium (DHE) est un colorant de fluorescence sensible aux superoxydes qui fournit des informations spécifiques sur les états des ROS intracellulaires. Le colorant DHE émet intrinsèquement une fluorescence bleue dans le cytoplasme. Cependant, lors de l’interaction avec les radicaux superoxydes, il se transforme en 2-hydroxyéthidium, qui émet une fluorescence dans les longueurs d’onde rouges (>550 nm) (Figure 1). Le colorant DHE est facilement transporté dans les cellul...

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Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour quantifier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires en utilisant le dihydroéthidium (DHE) comme sonde de colorant de fluorescence en utilisant une approche de criblage à haut débit. Le protocole décrit les méthodes d’évaluation quantitative des espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires dans les trois lignées cellulaires différentes de carcinome hépatocellulaire.

Reactive oxygen species (ROS) play a key role in the regulation of cellular metabolism in physiological and pathological processes. Physiological ROS ...

Notre laboratoire étudie l’impact des polluants environnementaux, comme les métaux lourds, sur la fonction hépatique et les maladies liées à la production d’espèces réactives de l’oxygène. Ce protocole vise à mesurer quantitativement les niveaux de ROS dans les cellules à l’aide d’une sonde de fluorescence au dihydroéthidium. Ce protocole utilise une plateforme de criblage à haut contenu pour mesurer quantitativement les niveaux d’espèces de ROS intracellulaires dans les lignées hépatocellulaires.La mesure précise du niveau de ROS intercellulaire est d’une importance cruciale dans l’étude toxicologique à haut débit, qui est un domaine d’intérêt clé dans notre laboratoire. La fluorescence DHE est une méthode très spécifique pour mesurer les niveaux totaux de ROS, ciblant en particulier le radical superoxyde, ce qui lui donne un avantage significatif sur les autres sondes de fluorescence ROS couramment utilisées. De plus, ce protocole offre la capacité unique de mesurer le niveau total de ROS cellulaires dans une plate-forme à haut débit.Notre protocole est un choix robuste et reproductible pour caractériser la production totale de ROS intracellulaires. Les approches à haut débit pour mesurer les niveaux de ROS sont utiles dans diverses études, telles que la toxicologie, le dépistage de médicaments et la biologie du cancer, sur lesquelles nous nous concentrerons à l’avenir.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput Screening Assessment of Reactive Oxygen Species (ROS) Generation using Dihydroethidium (DHE) Fluorescence Dye

3.1K vues.  University of New Mexico. Notre laboratoire étudie l’impact des polluants environnementaux, comme les métaux lourds, sur la fonction hépatique et les maladies liées à la production d’espèces réactives de l’oxygène. Ce protocole vise à mesurer quantitativement les niveaux de ROS dans les cellules à l’aide d’une sonde de fluorescence au dihydroéthidium. Ce protocole utilise une plateforme de criblage à haut contenu pour mesurer quantitativement les niveaux d’espèces de ROS intracellulaires dans ...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Mesure à haut débit des niveaux de ROS intracellulaires dans les lignées hépatocellulaires

Reactive oxygen species (ROS) play a key role in the regulation of cellular metabolism in physiological and pathological processes. Physiological ROS production plays a central role in the spatial and temporal modulation of normal cellular functions such as proliferation, signaling, apoptosis, and senescence. In contrast, chronic ROS overproduction is responsible for a wide spectrum of diseases, such as cancer, cardiovascular disease, and diabetes, among others. Quantifying ROS levels in an accurate and reproducible manner is thus essential to understanding normal cellular functionality. Fluorescence imaging-based methods to characterize intra-cellular ROS species is a common approach. Many of the imaging ROS protocols in the literature use 2&#39;-7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) dye. However, this dye suffers from significant limitations in its usage and interpretability. The current protocol demonstrates the use of a dihydroethidium (DHE) fluorescent probe as an alternative method to quantify total ROS production in a high-throughput setting. The high throughput imaging platform, CX7 Cellomics, was used to measure and quantify the ROS production. This study was conducted in three hepatocellular cancer cell lines - HepG2, JHH4, and HUH-7. This protocol provides an in-depth description of the various procedures involved in the assessment of ROS within the cells, including - preparation of DHE solution, incubation of cells with DHE solution, and measurement of DHE intensity necessary to characterize the ROS production. This protocol demonstrates that DHE fluorescent dye is a robust and reproducible choice to characterize intracellular ROS production in a high-throughput manner. High throughput approaches to measure ROS production are likely to be helpful in a variety of studies, such as toxicology, drug screening, and cancer biology.

This protocol describes a novel method to quantify intracellular reactive oxygen species (ROS) using dihydroethidium (DHE) as a fluorescence dye probe using a high-throughput screening approach. The protocol describes the methods for quantitative assessment of intracellular reactive oxygen species (ROS) in the three different hepatocellular carcinoma cell lines.