ELIME (אנזימים מקושרים חיסונית מגנטי אלקטרוכימי) שיטת איתור Mycotoxin

Summary

פרוטוקול לזהות trichothecenes (mycotoxins של דאגה לבריאות האדם) בשיטת ההקרנה החדשה שפותחה על בסיס שיטת immunochemical תחרותי זיהוי סופי אלקטרוכימיים מודגם.

Abstract

Immunoassays הם אלטרנטיבה חוקית ועד יקר יותר זמן רב כמותי HPLC או GC ^{1, 2} שיטות לאיתור הקרנת mycotoxins מסוכנים מצרכי מזון. בפרוטוקול זה אנו מראים כיצד לפברק ולחקור אנזים אלקטרוכימיים תחרותי assay immunomagnetic המקושרים המבוססים על שימוש של חרוזים מגנטיים תמיכה מוצקה עבור שרשרת immunochemical ³ ואלקטרודות מסך מודפס חישה פלטפורמה.

השיטה שלנו שואפת לקבוע את הסכום הכולל של HT-2 ו-T-2 רעלים, mycotoxins השייכת למשפחת trichothecenes ושל דאגה רבה לבריאות האדם ^4. השימוש שיבוט נוגדן עם תגובתיות צלב של 100% כלפי HT-2 ו-T-2 מאפשרת לזהות בו זמנית הן רעלים עם רגישות דומה ^5.

הצעד הראשון של assay שלנו היא הצעד ציפוי שבו אנו לשתק HT2-KLH רעלן המצומד על פני השטח של חרוזים מגנטיים. אחרי צעד חסימה, הכרחי כדי למנוע אי - קליטה ספציפיות, תוספת של נוגדנים חד שבטיים מאפשר תחרות בין משותקת HT-2 ו חינם HT-2 או T-2 להציג במדגם או מומס בתמיסה סטנדרטית.

בסוף שלב התחרות, כמות נוגדנים חד שבטיים קשור משותקת HT-2 יהיה ביחס הפוך לכמות רעלן בפתרון המדגם.

נוגדנים משני שכותרתו עם phosphatase אלקליין (AP) משמש כדי לחשוף את מחייב בין הנוגדן הספציפי משותקת HT-2. צעד המדידה הסופית מתבצעת על ידי הטלת aliquot ההשעיה חרוז מגנטי, המתאים פתרון מדגם מסוים / רגיל, על פני השטח של האלקטרודה המסך המודפס עבודה; חרוזים מגנטיים הם משותקים ומרוכז באמצעות מגנט ממוקם בדיוק מתחת מסך מודפס אלקטרודה. אחרי שתי דקות של דגירה בין חרוזים מגנטיים מצע עבור AP, המוצר האנזימטית הוא זוהה על ידי Voltammetry דיפרנציאלי Pulse (DPV) באמצעות מכשיר נייד (PalmSens) יכול גם ליזום באופן אוטומטי eight מדידות תוך הפסקה של כמה שניות.

Protocol

1) חסימה חרוזים מגנטיים מצופה:

המשך כמו בצע לחסום חרוזים מגנטי מצופה:

1. הכן מערכת של 2 צינורות מ"ל Eppendorf;
2. Homogenize (רועד אך לא vortexing) חרוזים מגנטיים מצופה (ראה נספח להכנת חרוזים מגנטיים מצופה) באמצעות מדגם מסתובבת מערבל;
3. מיד לאחר homogenization, פיפטה 10 μl של חרוזים מגנטיים מצופה לתוך כל צינורות נפרדים Eppendorf;
4. הוסף 1ml של חלב דל שומן חוסם פתרון לתוך הצינור כל Eppendorf של קבוצת;
5. תנו חרוזים מגנטיים דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מיקסר מדגם מסתובב;
6. הסרת חסימה הפתרון: לעשות זאת במקום הצינורית concentrator החלקיקים המגנטיים עם החלק המגנטי לשים על 2 דקות (ראה חרוזים מגנטיים דבק על הקיר לרוחב של הצינור); בזהירות פיפטה את supernatant, עוזב חרוזים באין מפריע;
7. הוסף 1 מ"ל של PBS חיץ NaN + ₃ + BSA כפתרון אחסון עבור כל צינור;
8. חנות חרוזים מגנטיים מצופה חסום ב 4 ° C (שים לב חרוזים מגנטיים מצופה יציבים לפחות 2 חודשים 4 ° C);

2) שרשרת החיסוני על חרוזים מגנטיים לבנייה של עקומת הכיול וניתוח מדגם

המשך כמו בצע יש חרוזים מגנטיים מוכן למדידה:

1. קח אחד Eppendorf צינור (2 מ"ל) של פתרון מצופה חסומים לחלץ כל דגימה שאתה הולך לנתח;
2. קחו צינור נוסף Eppendorf לפתרון כל calibrant עבודה;
3. Homogenize חרוזים מגנטיים עבור 2 דקות על מיקסר מדגם מסתובב לפני השימוש;
4. הסרת נוזל אחסון באמצעות concentrator החלקיקים המגנטיים;
5. לשטוף חרוזים מגנטיים שלוש פעמים עם פתרון PBS / BSA כביסה. הסר כביסה נוזלי;
6. שלב התחרות: הוסף עבור כל שפופרת המכילה חרוזים שטף מגנטי, 200μl מדגם מוכן לחלץ; להשתמש באחד צינור חרוז מגנטי עבור כל דגימה. חזור על אותו תהליך עבור כל פתרון סטנדרטי. הוסף 200 μl של פתרון נוגדן חד שבטי כדי צינור כל חרוז מגנטי. תנו חרוזים מגנטיים דגירה במשך חצי שעה על מיקסר מדגם מסתובב בטמפרטורת החדר;
7. הסר צינורות Eppendorf הפתרון משמש שלב התחרות;
8. תיוג צעד: הוסף 400μl של נוגדנים משני שכותרתו כל צינור מגנטי Eppendorf חרוז. תנו חרוזים מגנטיים דגירה במשך חצי שעה על מיקסר מדגם מסתובב בטמפרטורת החדר;
9. הסר תיוג פתרון משפופרות Eppendorf;
10. לשטוף חרוזים מגנטיים שלוש פעמים עם PBS / tween ® 20 הפתרון כביסה. הסר את נוזלי;
11. Resuspend עם 100μl של ה-DEA חיץ כל aliquot חרוזים מגנטיים. עכשיו חרוזים מגנטיים מוכנים לשלב מדידה אלקטרו;

3) האסיפה של PalmSens עם מרבב (MUX) אפשרויות

שימו לב: מוצר הידרוליזה אנזימטית של המצע עבירות על פני האלקטרודה, ומסיבה זו אלקטרודה חדשה נדרשת לכל מדידה.

1. חיבור המחשב הנייד כדי PalmSens דרך כבל סדרתי;
2. חבר את תקע 9-DIN של מרבב CH8 עם PalmSens.
3. חיבור כבל טורי של קשר שמונה ערוץ Mux חשמלי עם מרבב CH8;
4. אלקטרודה מקום רצועה ברחוב מגנט שמונה. שימו לב בכל מקום מגנט תחת כל אלקטרודות עבודה (לשים לב, את הצורך של מגנט יחיד עבור כל אלקטרודה הכרחי אחרת החלקיקים המגנטיים לא יהיה מרוכז באזור האלקטרודה עובד);
5. חבר את רצועת אלקטרודות במגע eight ערוץ Mux חשמלי;

עבור המדידה DPV להשתמש בפרמטרים הבאים בתיבות המתאימות:
E להתחיל: 0 (V); בסוף E: 0.6 (V); צעד E: 0.016 (V); E הדופק: 0.0339 (V); E מיזוג: 0 (V); בתצהיר E: 0 (V); קצב סריקה : 0.1 (V / s); T הדופק: 0.06 (ים); מיזוג T: 0 (s); בתצהיר T: 0 (s); איזון T: 8 (ים).

4) התגובה האנזימטית אלקטרוכימי מדידה

1. Homogenize ידי בעדינות רועד כל צינור Eppendorf המכילה חרוזים מגנטיים מוכן לשלב מדידה אלקטרו מנת לקבל השעיה מפוזר היטב של חרוזים מגנטיים;
2. פיפטה מכל Eppendorf, מיד לאחר homogenization, aliquot של 20 μl של פיזור חרוז מגנטי על משטח אלקטרודה המקביל העבודה. עבור כל אלקטרודה של להשתמש באחד רצועה 20 μl של חרוזים מגנטיים שנלקחו שונים צינורות Eppendorf (למשל לשימוש eight eight אלקטרודה Eppendorf שונים);
3. הוסף 80 μl של פתרון המצע אנזימטית על האלקטרודה הראשונה. התחל 2 דקות לספור למטה. לאחר 14 שניות, להוסיף 80 μl של פתרון המצע אנזימטית על האלקטרודה השנייה. אחרי עוד 14 שניות, להוסיף 80 μl של פתרון המצע אנזימטית על האלקטרודה השלישית. המשך ב int באותו זמןerval (14 שניות) עד אלקטרודה האחרון (כלומר: כל טיפה aliquot המצע במרווחים של 14 שניות). השעה מרווח של 14 שניות מחושב הזמן הנדרש על ידי potentiostat לבצע את המדידה, של לב, הפתרון 80 μl על חיישן זה אמור לכסות את האלקטרודה, עובד התייחסות נגדית. יתר על כן, פתרונות חיישן אחד לא צריך לבוא במגע עם פתרונות של אלקטרודות השכנות.
4. לאחר 2 דקות לספור למטה בנוסף הראשון של פתרון המצע האנזימטית, להתחיל את המדידה אלקטרוכימי;
5. השתמש Lite PalmSens תוכנה כדי להשיג פסגות הנוכחי (μA) עבור כל פתרון.

5) חישוב

הקמת עקומת כיול באמצעות משוואה לוגיסטית 4 פרמטרים ולחשב את ריכוז כמות HT-2/T-2 סך הרעלן ננוגרם למיליליטר עבור כל שפופרת המכילה Eppendorf מדגם לא ידוע.

נתוני הניסוי, גובה השיא (μA) נגד ריכוז calibrants (ng / ml), צריך להיות מצויד שימוש שאינו ליניארי ארבע פרמטר לוגיסטי (4-PL) העלילה המשוואה (1) (באמצעות מגרש סיגמא 8.0 או Kaleidagraph). המודל קוי 4-PL מאומץ בדרך כלל כדי לתאר את מבחני מחייב ליגנד (LBAs) ^6.

(1)
a, b, x0, Y0 פרמטרים לוגיסטיים כמו שניתן על ידי תוכנית עקומת Sigma מגרש מתאים.
השתמש בנוסחה כדי לחשב ולהסביר את התוכן של הסכום הכולל HT-2/T-2 הרעלן הפתרון מדגם בדילול לחלץ
(2)
x הוא ריכוז מסה של הסכום הכולל של HT-2/T-2 רעלים פתרון תמצית מדוללת, מחושב מן המשוואה 4 פרמטרים לוגיסטי Nanogram לכל milliltre (ng / ml)
y הוא הערך הנוכחי μA שהתקבלו במדגם לא ידוע

נספח

6) חרוזים מגנטיים מצופה

המשך כמו בצע יש חרוזים מגנטי מצופה:

כביסה נוהל

1. Homogenize Dynabeads tosylactivated ® M-280 (פתרון המניה 2 x 109 חרוזים / ml) על ידי רועדת vortexing (מהירות מרבית) דקות 1 (למנוע הקצפה) (נא לציין את הריכוז של חרוזים מגנטיים צריך להיות תמיד זהה, כדי להבטיח שחזור ב המדידה);
2. מיד פיפטה 1 מ"ל של חרוזים הומוגני לעיל לתוך צינור 2 Eppendorf מ"ל;
3. מניחים את הצינורית concentrator החלקיקים המגנטיים עם החלק המגנטי לשים על 2 דקות (ראה חרוזים מגנטיים דבק על הקיר לרוחב של הצינור);
4. בזהירות פיפטה את supernatant, עוזב חרוזים באין מפריע;
5. הוצא את הצינור מתוך Eppendorf concentrator החלקיק המגנטי resuspend את החרוזים מ"ל 1 של ה-pH 0.1 borate חיץ M 9.5. מערבבים בעדינות במשך 2 דקות במיקסר המדגם סיבוב 2 דקות;
6. פיפטה את supernatant;
7. פיפטה 1 מ"ל של תמיסת חיץ borate לתוך הצינור Eppendorf. חרוזים מגנטיים נמצאים כעת מוכן לשלב ציפוי;

ציפוי נוהל

8. מוסיפים 600 מ"ל של HT-2 מצומדות עם פתרון (Hemocyanin Keyhole צלחית) מניות KLH כדי מ"ל 1 של חרוזים מגנטיים) (סופי HT-2-KLH ריכוז של 375 מ"ג / מ"ל); חרוזים מגנטיים לדגור HT-2-KLH פתרון 20h ב 37 ° C * עם סיבוב איטי על הטיה וסיבוב מיקסר מדגם;
9. אחרי מקום דגירה את הצינורית concentrator החלקיקים פיפטה מגנטי את supernatant;
   לשטוף חרוזים מצופים פעמיים עם 1 מ"ל של תמיסת PBS / BSA חיץ. בין כביסה להסיר כל PBS / BSA פתרון. כל צעד כביסה בוצעו הגדרה חרוזים מגנטיים PBS / BSA על מערבל סיבוב 5 דקות;
10. לשטוף חרוזים מגנטיים פעם באמצעות 1 מ"ל של תמיסת טריס / BSA חיץ. הסר טריס / פתרון BSA. ביצוע שלב זה על ידי הגדרת חרוזים מגנטיים טריס / BSA חיץ על סיבוב מערבל עבור 4 שעות ב 37 ° C *;
11. לשטוף חרוזים מגנטיים פעם באמצעות 1ml של רענון (נשמר במקרר ב 4 מעלות צלזיוס) PBS / פתרון BSA חיץ. הסר PBS / BSA פתרון. ביצוע שלב זה הגדרה חרוזים מגנטיים PBS / BSA חיץ על סיבוב מערבל עבור 5min בטמפרטורת החדר;
12. אחרי כביסה צעד להסיר את כל נוזל כביסה להוסיף 1 מ"ל PBS חיץ NaN + ₃ + BSA כנוזל האחסון;
13. חנות חרוזים מגנטיים מצופה ב 4 ° C (שים לב חרוזים מגנטיים מצופה יציבים לפחות 2 חודשים 4 ° C);

* לצורך זה מערבל ממוקם בתנור מצויד עם חור המאפשר הכניסה של כבל אספקת החשמל. לחלופין המיקסר יכול להיות ממוקם בחדר thermostated על 37 ° C.

7) Sample הכנה מיצוי

25 גרם של דגימת טחון (אוכל ארוחת בוקר או דגנים לתינוק) אנחנוighed לצנצנת בלנדר והוציא עם 100 מ"ל של אצטוניטריל / פתרון המים (86/14) במשך 3 דקות במערבל במהירות גבוהה. לאחר צנטריפוגה ב 4000 סל"ד (3,000 גרם) במשך 5 דקות, 8 מ"ל של supernatant נלקחו מטוהרים עם טור Mycosep, 4 מ"ל של לחלץ את ניקו יובשו תחת זרם חנקן. דגימות יבשים יכולים להיות מאוחסנים ב -30 ° C עד מספר חודשים.

8) הכינון מחדש לדוגמא

ארוחת בוקר דגנים

מחדש את ארוחת הבוקר לחלץ דגנים יבשים (מזון דגנים מבוסס שהופנתה לצריכה מבוגר) עם 40 מ"ל של PBS pH 7.4. בדרך זו מדגם עם ריכוז של רעלן שווה להגביל המשפטי אמור (200 ng / g) ייתן בשלב המדידה אות נופלת באמצע טווח העבודה.

מזון לתינוקות

מחדש מזון יבש לחלץ תינוק (אוכל דגני בוקר המבוססים שהופנתה לצריכה התינוק) עם 4 מ"ל של PBS. בדרך זו מדגם עם ריכוז של רעלים שווה להגביל המשפטי אמור (20-25 ng / g) ייתן בשלב המדידה אות נופלת באמצע טווח העבודה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השימוש נוגדנים כמו בדיקה הכרה biomolecular ראה השימוש הנרחב בטכנולוגיות חישה; מתודולוגיות גילוי immunochemical, כגון ELISAs ו MEIAs, נמצאים, כיום, בין פלטפורמות השתמשו ביותר מיושם במעבדות רבות ^7.

בעוד הגישות הללו להשיג רגישות וספציפיות חריגי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
אשלגן כלורי	סיגמא	P9333
אשלגן זרחתי dihydrogen	סיגמא	P9791
Disodium פוספט מימן	סיגמא	S3264
נתרן כלורי	סיגמא	S3014
MgCl 2 anhydrous	סיגמא	M8266
ה-DEA (99.5%)	סיגמא	31589
HCl 37%	סיגמא	320331
H 3 BO 3	סיגמא	B6768
טריס [hydroxymethyl]-aminomethane	סיגמא	252859
ארגון ה-BSA (אלבומין בסרום שור)	סיגמא	A4503
NaOH	סיגמא	S5881
Tween 20	סיגמא	P9416
3 NaN	אלדריץ'	71290
1-Naphthyl disodium מלח פוספט	Fluka	N7255
חלב פתרון ריפרף חסימת - ללא חלב יבש שומן	Bio-Rad	170-6404
HT-2 מצומדות עם KLH (Hemocyanin Keyhole צלחית), פתרון מניות (1 מ"ג / מ"ל ​​PBS):	Biopure	004050	HT-2-KLH המצומד הושג על ידי שיטת-CDI שם חופשי OH-לקבוצות על המיקום 3 ו -4 על רעלן HT-2 היו מופעלים על ידי N, N'-carbonyldiimidazole (CDI) ואת הפעלת HT-2 היה רעלן בואו להגיב aminogroups של החלבון (KLH) כדי ליצור הצמדה carbammate יציב.
נוגדן הנקרא משניים: אנטי עכבר IgG (H + L) מסוס, מצומדות עם phosphatase אלקליין, בריכוז 1 מ"ג / מ"ל.	וקטור מעבדות	AP-2000
HT-2 רעלן	Biopure
חרוזים מגנטיים: Dynabeads ®	Dynal	M-280 Tosylactivated	ריכוז 2 x 10 9 חרוזים / ml.

שם מגיב	הכנה	הערות (אופציונלי)
שנאגרו מלוחים פוספט (PBS), pH 7.4	להמיס 0.20 גרם של אשלגן כלורי, 0.20 גרם של אשלגן dihydrogen פוספט, 1.16 גרם של מימן disodium פוספט ו 8.00 גרם של נתרן כלורי ב 900 מ"ל מים
Diethanolamine חיץ, DEA, 0.97 מ '+ 1 mM MgCl 2 + 0.15 M KCl, pH 9.8	ממיסים 0.0476g של MgCl 2 anhydrous ו 7.3.59 גרם של KCl ב ~ 300 מ"ל מים. לאחר פירוק להוסיף 51 מ"ל של ה-DEA (99.5%). התאם ל-pH 9.8 עם HCl (6 ז). מדולל 500 מ"ל מים.
חיץ borate, 0.1 מ ', pH 9.5	להמיס 3.09 גרם של H 3 BO 3 ב ~ 300 מ"ל של מים מזוקקים, כדי להתאים את pH 9.5 עם NaOH ו / או HCl (6 M או בריכוזים נמוכים). מדולל 500 מ"ל עם מים מזוקקים.
טריס חיץ, 0.2 מ ', pH 8.5	להמיס 3.85 גרם של טריס [hydroxymethyl]-aminomethane ב 100 מ"ל מים. התאם ל-pH 8.5 עם NaOH ו / או HCl (6 M או בריכוזים נמוכים). מדולל ל 200 מ"ל מים.
טריס חיץ + BSA פתרון (0.1%), pH 8.4	ממיסים 0.050 גרם של BSA ב 50 מ"ל של חיץ טריס pH 8.4.	פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש.
PBS חיץ + tween ® 0.05%	ממיסים 0.250 גרם tween 20 ב 500 מ"ל של הכינו בעבר PBS חיץ, pH 7.4
PBS חיץ + BSA פתרון 0.1%	ממיסים 0.050 גרם של BSA ב 50 מ"ל של PBS חיץ, pH 7.3.	פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש.
PBS חיץ BSA + 0.1% + NaN 3 0.02%	ממיסים 0.050 גרם ו - 0.010 BSA של NaN 3 ב 50 מ"ל של PBS חיץ, pH 7.3.	אחסון סולution
אנזימתי המצע	ממיסים 0.010 גרם של מלח 1-Naphthyl סודיום פוספט ב 100 מ"ל של pH חיץ DEA 9.8. לעטוף את הבקבוק היטב בנייר אלומיניום.	פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש.
חלב פתרון ריפרף חסימת	הוסף 0.20 גר 'של סופג חוסם כיתה ללא שומן חלב יבש (Bio-Rad, הרקולס, קליפורניה, ארה"ב) עד 200 מ"ל של PBS חיץ pH 7.3.	פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש.
HT-2 מניות פתרון	להמיס 10 מ"ג של הבקבוקון trichothecene HT-2 רעלן, ב 10 מ"ל של אצטוניטריל לתת פתרון עם ריכוז של 1 מ"ג / מ"ל.	פצל את הפתרון הזה לתוך לשימוש יחיד aliquots של 30 מ"ל ולאחסן אותם בפחות מ -30 ° C.
HT-2 עבודה פתרון סטנדרטי	פיפטה 20 מ"ל של תמיסת HT-2 מניות רעלן לתוך מ"ל 2 מכויל בקבוק volumetric ו לדלל עם אצטוניטריל להשיג פתרון HT-2 עבודה המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​של רעלן trichothecene.	פתרון זה אמור להיות מוכן טרי ביום השימוש.
HT-2 calibrant פתרונות עבודה	לדלל את הפתרון HT-2 תקן עובדים (10 מיקרוגרם / מ"ל) להכין פתרון calibrant עובד 100 ng / ml. מדולל HT-2 עובדים פתרון calibrant 100 ng / ml להכין עבודה פתרונות calibrant הריכוזים הבאים 0 (ריק), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng / ml.	פתרונות אלה צריכים להיות מוכנים טריים ביום השימוש.
HT-2 מצומדות עם KLH	פצל את HT-2 מצומדות עם פתרון (Hemocyanin Keyhole צלחית) מניות KLH (1 מ"ג / מ"ל ​​PBS) לתוך לשימוש יחיד aliquots של μl 350.	חנות aliquots ב -30 ° C.
נוגדן חד שבטי ספציפי	מדולל 1:350 (v: v) את ריכוז מניות (1.383 מ"ג / מ"ל) של נוגדנים חד שבטיים ב PBS להשתמש בשלב התחרות	פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ברגע השימוש. 10 מניות מ"ל נוגדן פתרון PBS עבור נפח סופי של 3.5 מ"ל, הם מספיק כדי לנתח 17 תקנים ו / או דוגמאות.
נוגדן תווית משני	אנטי עכבר IgG (H + L) מצומדות עם phosphatase אלקליין הוא מדולל 1:100 (v: v) ב-PBS להשתמש בשלב התחרות.	100 μl נוגדן מניות פתרון PBS עבור נפח סופי של 10 מ"ל, הם מספיק כדי לנתח 25 תקנים ו / או דוגמאות. פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ברגע השימוש.

שם מגיב	חברה	הערות (אופציונלי)
חלקיקים מגנטיים מרוכז: MPC ®-S	Dynal
PalmSens מכשיר	PalmSens	מסופק עם PalmSens לייט, כבל חיבור טורי מחשב נייד ו Mux תוכנה אפשרויות
CH8 PalmSens מרבב	PalmSens
שמונה Mux ערוץ מגע חשמלי	עבודת יד
רצועת עם שמונה אלקטרודות מסך מודפסים (SPES)	עבודת יד
תמיכה תוכנן במיוחד עבור רצועת אלקטרודות	עבודת יד	כולל 8 מגנטים ניאודימיום שכל אחד מהם ממוקם מתחת לפני השטח כל אלקטרודה העבודה של SPE
Microliter pipettes מכויל	Gilson
Stirrer מגנטי וברים ומערבבים.
זכוכית כוסות (100, 50, 20 מ"ל).
נפחית צלוחיות (2ml).
0.2 ו 2ml Eppendorf צינורות.	Eppendorf
פלקון ™ שפופרות של 5 מ"ל ו - 15 מ"ל.	בז
מעבדה וורטקס מערבל		אין להשתמש במיקסר מערבולת כדי resuspend חרוזים מגנטיים מצופה HT2-KLH או מקושרים עם שרשרת החיסונית כדי למנוע denaturing חלקים proteic
מעבדה תנור או חדר thermostated		בחרו תנור מסוגלים לשמור על טמפרטורה של 37 ± 3 ° C.