진균 독소의 검출을위한 ELIME (효소가 단백질 자기 전기를 연결) 방법

요약

경쟁력있는 immunochemical 방법과 최종 전기 감지 기능을 기반으로 새로 개발된 검사 방법을 사용하여 trichothecenes을 (인간의 건강에 대한 우려의 mycotoxins) 감지하는 프로토콜이 증명됩니다.

초록

Immunoassays은 더 비싼과 시간이 소요되는 정량 HPLC 또는 GC ^1, 식품 상품에 유해 mycotoxins의 심사 검출을위한 ² 가지 방법에 대한 유효한 대안입니다. 이 프로토콜에서는 플랫폼을 감지으로 immunochemical 체인 ³ 화면 인쇄 전극에 대한 견고한 지원과 같은 자성 구슬의 사용에 따라 연결 immunomagnetic 분석을 조작하고 전기 경쟁력있는 효소를 심문하는 방법을 보여줍니다.

우리의 방법은 HT - 2 T - 2 독소의 총 금액 trichothecenes 가족과 인간의 건강 ⁴ 큰 우려에 속하는 먹은 사람은 미세 독소를 섭취하게 결정하는 것을 목표로하고있다. HT - 2 및 T - 2 향한 100 % 교차 반응과 항체 클론의 사용은 동시에 유사한 민감도 ⁵ 독소를 모두 검색할 수 있습니다.

우리의 분석의 첫 번째 단계는 우리가 자기 구슬의 표면에 HT2 - KLH 공액 독소를 무력화 코팅 단계입니다. 불특정 absorptions을 피하기 위해 필요한 차단 단계 후, 단클론 항체의 추가는 허용 고정화 HT - 2와 샘플 무료 HT - 2 T - 2 현재 또는 표준 용액에 녹아있는 사이의 경쟁.

경쟁 단계의 끝에, 단클론 항체의 양을는 링크된 HT - 2 샘플 솔루션에 독소의 금액에 반비례한다 고정화.

알칼리성 인산 가수 분해 효소 (AP)로 표시 이차 항체는 특정 항체와 고정화 HT - 2 사이의 바인딩을 공개하는 데 사용됩니다. 최종 측정 단계는 화면 인쇄 작업 전극의 표면에 특정 샘플 / 표준 용액에 해당하는, 자기 비드 정지 나누어지는 놓아 수행, 자석 구슬은 아래에 정확하게 위치 자석에 의해 고정하고 집중되고있다 화면 인쇄 전극. 자기 구슬과 AP의 기판 사이에 부화 두 분 후에 효소 제품은 몇 초 간격 이내에 자동으로 팔 측정을 시작하는 것도 가능 휴대용 악기 (PalmSens)를 사용하여 차동 펄스 Voltammetry (DPV)에 의해 감지됩니다.

프로토콜

1) 코팅 자성 비즈를 차단 :

로 코팅 자기 구슬을 차단 따라 진행 :

1. 2 ML Eppendorf 튜브 세트를 준비;
2. ; (vortexing하지 떨고 있지만) 믹서 회전 샘플을 사용하여 코팅 자기 구슬을 (코팅 자성 비즈의 준비에 대한 부록 참조) 균질
3. 즉시 균질 후 피펫 각각 별도의 Eppendorf 튜브에 코팅 자기 구슬 10 μl;
4. 설정의 각 Eppendorf 튜브에 솔루션을 차단 무지방 우유의 1ml을 추가;
5. 회전 샘플 믹서에 실온에서 30 분 품어 자기 구슬을합시다;
6. 솔루션 차단 제거 : 2 분 (튜브의 측면 벽에 튀어나와 자기 구슬을 참조)에 넣어 자석 부분 자기 입자 농축기에 튜브를 삽입 이렇게로, 신중하게 구슬은 그대로두고, 뜨는을 피펫;
7. PBS 버퍼 + 난 ₃ + BSA 각 튜브위한 스토리지 솔루션으로 1 ML 추가;
8. 4 코팅 및 차단 자기 구슬을 저장 ° C (코팅 자성 비즈 4 ° C에서 최소 2 개월 안정 것에주의하십시오);

교정 곡선의 건설 및 샘플 분석을위한 자성 비즈 2) 면역 체인

측정 준비가 자기 구슬을 가지고 다음과 같이 진행 :

1. 이 분석가는 각 샘플 추출을위한 코팅 및 차단 솔루션 중 하나 Eppendorf 튜브 (2 ML)를 타고;
2. 각 작업 calibrant 솔루션 추가 Eppendorf 튜브를 타고;
3. 사용하기 전에 회전 샘플 믹서 2 분 자기 구슬을 균질;
4. 자기 입자 농축기를 사용하여 스토리지 액체를 제거;
5. PBS / BSA 세척 솔루션 자석 구슬 세 번 씻으십시오. 액체를 세척 제거;
6. 경쟁 단계 : 준비 추출 시료의 200μl 씻어 자기 비즈를 포함한 각각의 튜브에 대한 추가, 각 시료에 대해 하나 마그네틱 비드 튜브를 사용합니다. 각 표준 용액에 대해 동일한 절차를 반복합니다. 각각의 자석 구슬 튜브에 단클론 항체 용액 200 μl를 추가합니다. 자석 구슬은 상온에서 회전 샘플 믹서에 반 시간 동안 품어 보자;
7. Eppendorf 튜브에서 경쟁 단계에 사용되는 솔루션을 제거;
8. 단계를 레이블 : 각 마그네틱 비드 Eppendorf 튜브에 표시 이차 항체의 400μl를 추가합니다. 자석 구슬은 상온에서 회전 샘플 믹서에 반 시간 동안 품어 보자;
9. Eppendorf 튜브에서 솔루션을 라벨링 제거;
10. 자석 구슬에게 PBS / 트윈과 함께 세 번 ® 20 세척 솔루션을 씻으십시오. 액체를 제거;
11. DEA 버퍼의 100μl 자석 구슬의 각 나누어지는와 Resuspend. 이제 자기 비즈는 전기 측정 단계에 대한 준비가되어;

멀티플렉서 (MUX) 옵션과 함께 PalmSens 3) 조립

참고 : 기판 가수 분해 효소의 제품은 전극 표면을 파울, 이런 이유로 새로운 전극은 각 측정을 위해 필요합니다.

1. 직렬 케이블을 통해 PalmSens에 PC 노트북에 연결;
2. PalmSens과 CH8 멀티플렉서의 9 - DIN 플러그를 연결합니다.
3. CH8 멀티플렉서가있는 8 채널 MUX 전기 접촉의 직렬 케이블을 연결합니다;
4. 8 자석 블록에 삽입 전극 스트립. 각 작업 전극 아래에 각각의 자석을 배치주의 (참고의, 각 전극에 대해 하나의 자석의 필요 달리 자석 입자가 작업 전극 지역에 집중되지 않습니다 필수적입니다);
5. 여덟 채널 MUX 전기 접촉 전극 스트립에 연결;

DPV 측정에 해당하는 상자에 다음 매개 변수를 사용
E 시작 : 0 (V), E 끝 : 0.6 (V), E 단계 : 0.016 (V); E 펄스 : 0.0339 (V); E 에어컨 : 0 (V), E 증착 : 0 (V), 스캔 속도를 : 0.1 (V / S), T 펄스 : 0.06 (S), T 컨디셔닝 : 0 (S), T 증착 : 0 (S), T의 평균 : 8 (S).

4) 효소 반응과 전기 화학 측정

1. 부드럽게 자기 구슬을 잘 분산된 현탁액을 얻기 위해서는 전기 측정 단계에 대한 준비가 자기 구슬을 포함하는 각 Eppendorf 튜브를 흔들어하여 균질;
2. 바로 균질 후 각 Eppendorf에서 피펫, 해당 작업 전극 표면에 자성 비드 분산의 20 μl의 나누어지는. 한 스트립을 사용 각각의 전극 다른 Eppendorf 튜브 (8 전극 사용 8 개 Eppendorf에 대한 예)에서 촬영한 자기 구슬 20 μl에 대한;
3. 첫 번째 전극에 효소 기판 솔루션의 80 μl를 추가합니다. 2 분 카운트 다운 시작합니다. 14 초 후, 두 번째 전극에 효소 기판 솔루션의 80 μl를 추가합니다. 추가로 14 초 후, 세 번째 전극에 효소 기판 솔루션의 80 μl를 추가합니다. 동시에 INT에서 진행마지막 전극 (14 초 간격과 기판의 각 나누어지는를 드롭 의미)까지 erval (14 초). 14 초의 간격 시간은 측정을 수행할 수있는 potentiostat에 필요한 시간 계산, 노트, 각 센서에 80 μl 솔루션은 작업, 참조 및 카운터 전극을 커버한다. 또한, 각 센서에 대한 솔루션은 인접한 전극의 솔루션을 접촉해서는 안됩니다.
4. 2 분 효소 기판 솔루션의 첫 번째 이외의 카운트 다운 후, 전기 측정을 시작합니다;
5. 각 솔루션에 대한 현재의 봉우리 (μA)를 얻기 위해 PalmSens 라이트 소프트웨어를 사용합니다.

5) 계산

물류 4 매개 변수 방정식을 사용하여 교정 곡선을 수립하고 미지의 샘플을 포함하는 각 Eppendorf 튜브에 대한 밀리리터 당 나노 그램 총 HT-2/T-2 독소 금액의 농도를 계산합니다.

실험 데이터 calibrants의 농도 (NG / ML)에 대한 피크 높이 (μA)는 비선형 안경 매개 변수 물류 (4 - PL) 시그마 플롯 8.0 이상을 사용 방정식의 음모 (1) (사용 장착되어 있어야 Kaleidagraph). 비선형 4 PL 모델은 일반적으로 리간드 바인딩 assays (LBAs) ^6를 설명하기 위해 채택됩니다.

(1)
시그마 플롯 곡선에 맞게 프로그램이 주어진 A, B는, y0는 물류 매개 변수 X0 있습니다.
희석 샘플 추출 솔루션 HT-2/T-2 독소 총 금액의 내용을 계산하는 수식을 사용 explicated
(2)
x는 milliltre 당 nanogram의 물류 사 매개 변수 방정식 (NG / ML)에서 계산된 희석 추출 솔루션에 HT-2/T-2 독소의 총 금액의 질량 농도는
y는 미지의 시료에 대해 얻은 μA의 전류 값이

부록

6) 코팅 자성 비즈

코팅 자기 구슬을 가지고 다음과 같이 진행 :

절차를 워싱

1. tosylactivated Dynabeads을 균질 ® M - 280 (재고 솔루션 2 X 109 구슬 / ML) 1 분 (거품 방지) (자성 구슬의 농도를 유의하시기 바랍니다의 재현성을 보장하기 위해 항상 동일해야합니다에 대한 떨고 (최대 속도) vortexing으로 측정);
2. 즉시 2 ML Eppendorf 튜브에 위의 균질 비즈 1 ML을 피펫;
3. 2 분 (튜브의 측면 벽에 튀어나와 자기 구슬을 참조)에 넣어 자석 부분 자기 입자 농축기에 튜브를 삽입;
4. 조심스럽게 구슬은 그대로두고, 뜨는을 피펫;
5. 자기 입자 농축기에서 Eppendorf 튜브를 제거하고 0.1 M borate 버퍼 산도 9.5 1 ML에있는 구슬을 resuspend. 2 분에 대한 회전 샘플 믹서 2 분 부드럽게 믹스;
6. 뜨는을 피펫;
7. Eppendorf 튜브에 borate 버퍼 솔루션의 피펫 1 ML. 마그네틱 구슬 지금은 코팅 단계에 대한 준비가되어;

코팅 절차

8. 부화 자기 구슬과 HT - 2 - KLH 솔루션, KLH (키홀의 림펫 Hemocyanin) 주식 자석 구슬 1 ML하는 솔루션) (375 MG / ML 최종 HT - 2 - KLH 농도)와 HT - 2 복합 600 ML 추가 20h 37 ° C * 샘플 믹서 회전에 속도 기울기 회전;
9. 부화 장소 뜨는에서 자기 입자 농축기와 피펫의 튜브 후;
   PBS / BSA 버퍼 솔루션 1 ML과 코팅 구슬 두 번 씻으십시오. 각 세척 사이 PBS / BSA 솔루션을 제거합니다. 모든 세척 단계는 5 분 회전 믹서에 자석 구슬과 PBS / BSA 설정을 수행했다;
10. 트리스 / BSA 버퍼 솔루션 1 ML을 사용하여 한 번 자기 구슬을 씻으십시오. 트리스 / BSA 솔루션을 제거합니다. 37 4 H 위해 믹서를 회전에 자성 비즈와 트리스 / BSA 버퍼를 설정하여이 단계를 수행 ° C *;
11. 상쾌 중 1ml를 (4 냉장고에 보관 ° C) PBS / BSA 버퍼 솔루션입니다. 사용하여 한번 자기 구슬 와시 PBS / BSA 솔루션을 제거합니다. 상온에서 5 분을위한 믹서 회전에 자성 비즈와 PBS / BSA 버퍼를 설정하는이 단계를 수행;
12. 단계는 모든 세탁 액체를 제거하고 추가 세척 후 1 ML PBS 버퍼 + 난 ₃ + BSA 저장 액체로;
13. 4 코팅 자기 구슬을 저장 ° C (코팅 자성 비즈 4 적어도 2 개월 안정는 것을 유의하십시오 ° C);

*이 목적 믹서는 전원 공급 장치의 케이블의 삽입을 허용하는 구멍을 갖춘 오븐에 배치됩니다. 또는 믹서는 ° C.는 37 thermostated 방에 배치 수

7) 샘플 준비 및 추출

잘게 지상 샘플 25g (아기 음식이나 아침 시리얼)은 우리 아르믹서 용기에 ighed 및 고속 믹서에서 3 분 acetonitrile / 물 솔루션 (14분의 86) 100 ML로 추출. 5 분 4,000 RPM (3000 G), 뜨는 8 ML이 Mycosep 칼럼로 찍은 및 정화되었다에서 원심 분리 후, 청소 추출 4 ML은 질소 흐름 하에서 건조되었다. 말린 샘플이 몇 개월 -30 ° C에서 최대 저장할 수 있습니다.

8) 샘플 reconstitution

아침 시리얼

Reconstitute PBS 산도 7.4의 40 ML과 말린 아침 시리얼 추출물 (시리얼 기반의 음식이 성인 소비 운명). 이런 방식으로되어 법정 한도 (200 NG / G)와 같은 독소의 농도와 예제는 측정 단계에서 작업 범위의 중간에 떨어지는 신호를 제공합니다.

유아식

PBS 4 ML과 Reconstitute 말린 베이비 푸드 추출물 (시리얼 기반의 식품 유아 소비 운명). 이런 방식으로되어 법정 한도 (20-25 NG / G)와 같은 독소의 농도와 예제는 측정 단계에서 작업 범위의 중간에 떨어지는 신호를 제공합니다.

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토론

biomolecular 인식 프로브로 항체의 사용은 감지 기술을 널리 사용 가능성을 보여줬습니다, 같은 ELISAs 및 MEIAs 같은 immunochemical 검색 방법론은 많은 실험실 ⁷ 가장 많이 사용되는 응용 플랫폼 간의 요즘입니다.

이러한 방식은 지난 몇 년 동안 뛰어난 감도와 특이성, 많은 연구 그룹의 주요 목표를 달성하는 동시에 공연의 개선과 최적화를하고 있습니다.

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자료

시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
염화칼륨	시그마	P9333
칼륨 dihydrogen 인산	시그마	P9791
나트륨 수소 나트륨	시그마	S3264
나트륨 염화물	시그마	S3014
MgCl 2 무수	시그마	M8266
DEA (99.5 %)	시그마	31,589
HCL 37%	시그마	320331
H 3 BO 3	시그마	B6768
트리스 [히드록시 메틸] - aminomethane	시그마	252859
BSA (소 혈청 알부민)	시그마	A4503
NaOH	시그마	S5881
트윈 20	시그마	P9416
난 3	알드리치	71,290
1 - 인산 나트륨 소금 Naphthyl	Fluka	N7255
무지방 우유 차단 솔루션 - 비 지방 건조 우유	바이오 래드	170-6404
KLH (키홀의 림펫 Hemocyanin), 주식 솔루션 (PBS 1 MG / ML)와 HT - 2 복합 :	Biopure	004050	HT - 2 - KLH 공액은 HT - 2 독소에 위치 3과 4에서 무료로 OH - 그룹이 N, N' - carbonyldiimidazole (CDI)과 활성 HT - 2 독소 였어요 활성화되었습니다 CDI - 방법으로 얻은 것입니다 안정 carbammate 연계를 생성하는 단백질 (KLH)의 aminogroups와 반응을 보자.
보조 라벨 항체 : 말에서 방지 마우스 IgG (H + L), 알카라인 인산 가수 분해 효소와 복합, 집중력 1 MG / ML.	벡터 연구소	AP - 2000
HT - 2 독소	Biopure
자기 구슬 : Dynabeads ®	Dynal	M - 280 Tosylactivated	농도 2 X 10 9 구슬 / ML.

시약의 이름	준비	댓글 (옵션)
인산은 생리 (PBS), pH를 7.4 버퍼	물 900 ML에 염화칼륨 0.20 g, 칼륨 dihydrogen 인산의 0.20 g, 나트륨 수소 나트륨 1.16 g의 나트륨 염화물의 8.00 g을 풀다
Diethanolamine 버퍼, DEA, 0.97 M + 1 ㎜ MgCl 2 + 0.15 M KCl, pH를 9.8	MgCl 2 무수 물 ~ 300 ML에서 KCl의 7.3.59 g의 0.0476g을 디졸브. 해산 후 DEA 51 ML (99.5 %)를 추가합니다. HCL (6 M)과 9.8으로 산도를 조정합니다. 물 500 ML로 희석.
Borate 버퍼, 0.1 M, pH를 9.5	증류수의 ~ 300 ML에 H 3 BO 3 3.09 g을 디졸브, NaOH 및 / 또는 HCL (6 M 이하 농도)를 9.5으로 산도를 조정합니다. 증류수 500 ML로 희석.
트리스 버퍼, 0.2 M, pH를 8.5	트리스 [히드록시 메틸] 물 100 ML 인 aminomethane의 3.85 g을 디졸브. NaOH 및 / 또는 HCL (6 M 이하 농도)로 산도 8.5을 조절할 수 있습니다. 물 200 ML로 희석.
트리스 버퍼 + BSA 용액 (0.1 %), 산도 8.4	트리스 버퍼 산도 8.4의 50 ML에 BSA의 0.050 g을 디졸브.	이 솔루션은 갓 이용 당일 준비하셔야합니다.
PBS 버퍼 + 트윈 ® 0.05 %	이전에 준비 PBS 버퍼, pH를 7.4 500 ML에 트윈 20 0.250 g을 풀다
PBS 버퍼 + BSA 용액 0.1 %	PBS 버퍼, 산도 7.3의 50 ML에 BSA의 0.050 g을 디졸브.	이 솔루션은 갓 이용 당일 준비하셔야합니다.
PBS 버퍼 + BSA 0.1 % + 난 3 0.02 %	PBS 버퍼, 산도 7.3의 50 ML에 0.050 BSA의 g와 할머니 3 0.010을 디졸브.	스토리지 솔ution
효소 기판	DEA 버퍼 산도 9.8의 100 ML 1 - Naphthyl 인산 나트륨 소금 0.010 g을 디졸브. 알루미늄 호일에 단단히 휴대용 술병을 넣어.	이 솔루션은 갓 이용 당일 준비하셔야합니다.
무지방 우유 차단 솔루션	PBS 버퍼 산도 7.3 200 ML에 학년 차단기 비 팻 건조 우유 (바이오 - 래드, 헤라클레스, CA, 미국)를 모래 바닥의 0.20 g을 추가합니다.	이 솔루션은 갓 이용 당일 준비하셔야합니다.
HT - 2 주식 솔루션	줄 acetonitrile 10 ML에 trichothecene HT - 2 독소의 약병 10 MG를 디졸브 1 MG / ML의 농도와 솔루션입니다.	30 ML의 단일 사용 aliquots에이 솔루션을 나눠 -30 ° C. 이하에서 그들을 저장
HT - 2 표준 용액 근무	2 ML로 HT - 2 독소 주식 솔루션의 피펫 20 ML은 용적 플라스크를 보정 및 10 μg / trichothecene 독소 ML을 포함 HT - 2 작업 솔루션을 얻기 위해 acetonitrile로 희석.	이 솔루션은 갓 이용 당일 준비되어야합니다.
HT - 2 작업 calibrant 솔루션	작업 calibrant 솔루션 100 NG / ML을 준비하는 HT - 2 작업 표준 용액 (10 μg / ML) 희석. 희석 HT - 2 calibrant 솔루션을 작업 100 NG / 다음과 같은 농도 0 (빈), 0.5, 1, 2, 4, 10 NG / ML의 calibrant 솔루션을 작업 준비 ML.	이 솔루션은 사용 당일 신선한 준비되어야합니다.
KLH와 HT - 2 복합	350 μl의 단일 사용 aliquots로 KLH (키홀의 림펫 Hemocyanin) 주식 솔루션 (PBS 1 MG / ML)와 HT - 2 복합 헤어졌다.	-30 ° C.에 저장 aliquots
특정 단클론 항체	경쟁 단계에서 사용하는 PBS의 단클론 항체의 주식 농도 (1.383 MG / ML) : 1:350 (V V)를 희석	이 솔루션은 사용의 순간에 신선한 준비하셔야합니다. 3.5 ML의 최종 볼륨 PBS에서 10 ML 항체 주식 솔루션은 17 표준 및 / 또는 샘플을 분석하는 데 충분합니다.
보조 라벨 항체	PBS 경쟁 단계에서 사용하는 : 알카라인 인산 가수 분해 효소와 함께 복합 방지 마우스 IgG (H + L)은 1:100 (V V)를 희석합니다.	10 ML의 최종 볼륨 PBS 100 μl 항체 주식 솔루션은 25 표준 및 / 또는 샘플을 분석하는 데 충분합니다. 이 솔루션은 사용의 순간에 신선한 준비하셔야합니다.

시약의 이름	회사	댓글 (옵션)
자기 입자 농축기 : MPC ® - S	Dynal
PalmSens 악기	PalmSens	PalmSens 라이트, 직렬 케이블 연결 PC 노트북 및 MUX 옵션 소프트웨어와 함께 제공된
CH8 PalmSens 멀티플렉서	PalmSens
에이트 채널 MUX 전기 문의	손으로 만든
여덟 화면 인쇄 전극 (SPEs)와 스트립	손으로 만든
전극 스트립을 위해 특별히 고안된 지원	손으로 만든	SPE의 각 작업 전극 표면 아래에 배치됩니다 각 8 네오디뮴 자석을 포함
보정 microliter의 pipettes	길슨
자기 활동가 및 저어 바.
유리 비커 (100, 50, 20 ML).
용적 flasks (2ml).
0.2 및 2ml Eppendorf 튜브.	Eppendorf
5ml와 15ml의 팰컨 ™ 튜브.	매
연구실 소용돌이 믹서		proteic 부품 denaturing 피하기 위해 면역 체인 HT2 - KLH로 코팅 또는 연결된 자기 구슬을 resuspend에 와동 믹서를 사용하지 마십시오
실험실 오븐이나 thermostated 방		37 온도 ± 3 ° C.를 유지할 수 오븐을 선택하십시오