Method Article
יון ניידות ספקטרומטריית מסה היא המתעוררים גז שלב טכנולוגיה שמפרידה יונים, המבוסס על ההתנגשות שלהם חתך ומסה. השיטה מספקת מידע תלת מימדי על טופולוגיה את הצורה הכוללת של קומפלקסים חלבונים. כאן, אנו המתאר הליך בסיסי לקביעת מכשיר ואופטימיזציה, כיול פעמים להיסחף, ופרשנות של נתונים.
יון ניידות (IM) היא שיטה אשר מודד את הזמן שנדרש עבור יון לנסוע דרך תא בלחץ תחת השפעה של שדה חשמלי חלש. המהירות שבה היונים חוצים את האזור להיסחף תלוי בגודל שלהם: יונים גדול יחוו מספר גדול יותר של התנגשויות עם גז אינרטי הרקע (בדרך כלל N 2) וכך לנסוע יותר לאט דרך המכשיר IM מאלו שמרכיבים יונים קטן יותר חתך. באופן כללי, הזמן שלוקח עבור היונים להעביר אף את השלב גז דחוס מפריד אותם, על פי ההתנגשות שלהם חתך (Ω).
לאחרונה, IM ספקטרומטריית היה יחד עם ספקטרומטריית מסה נודדת גל (T-wave) Synapt יון ניידות ספקטרומטר מסה (IM-MS) שוחרר. שילוב ספקטרומטריית מסה עם ניידות יון המאפשרת מימד נוסף של הפרדה מדגם הגדרה, מניב מגוון תלת ממדי (מסה לעת תשלום, עוצמה, ואת להיסחף). טכניקה זו מאפשרת הפרדה חפיפה ספקטרלית לירידה, ומאפשר ברזולוציה של קומפלקסים הטרוגנית עם מסה דומה מאוד, או המסה תשלום יחסי, אבל פעמים להיסחף אחר. יתר על כן, מדידות זמן להיסחף לספק נדבך חשוב של מידע מבניים, כמו Ω קשורה בצורת טופולוגיה הכוללת של יון. המתאם בין זמן הערכים שנמדדו להיסחף Ω מחושב באמצעות עקומת כיול שנוצר חלבונים calibrant עם חתכים מוגדר 1.
כוחה של גישה IM-MS טמונה ביכולתה להגדיר את האריזה למקטע ואת הצורה הכללית של מכלולים החלבון בריכוזים מיקרו, ו-near-פיזיולוגיים תנאים 1. מספר מחקרים IM האחרונות של שני חלבונים בודדים 2,3 ולא קוולנטיים קומפלקסים חלבונים 4-9, הפגינו בהצלחה כי מבנה החלבון הרביעון נשמר בשלב גז, הדגיש את הפוטנציאל של גישה זו במחקר של מכלולים חלבון הגיאומטריה לא ידוע . כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של ניתוח IMS-MS של קומפלקסים חלבונים באמצעות Synapt (quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) מכשיר HDMS (ווטרס בע"מ; רק מכשיר מסחרי IM-MS זמין כרגע) 10. אנו מתארים את השלבים אופטימיזציה בסיסית, כיול של התנגשות חתכים, שיטות לעיבוד נתונים לפרשנות. השלב הסופי של פרוטוקול דן שיטות לחישוב תיאורטי ערכים Ω. באופן כללי, הפרוטוקול אינו מנסה לכסות כל היבט של אפיון IM-MS של מכלולים חלבון, אלא מטרתו היא להציג את ההיבטים המעשיים של שיטת לחוקרים חדשים בתחום.
ההליך אנו מתארים מתמקד אך ורק על ניתוח IM-MS של קומפלקסים חלבונים. לכן, אנו ממליצים החוקרים בקיא בתחום MS מבניים מתייחסים הכנת הצעדים מדגם, כיול המכשיר ו-MS ו-MS במקביל הליכי אופטימיזציה המתואר קירשנבאום et al. Http://www.jove.com/index/details 2009. stp? ID = 1954. באופן כללי, פרוטוקול זה כרוך ריכוזים נמוכים של מיקרו מורכבת (10-20 מיקרומטר) ב חיץ נדיפים כגון אמוניום אצטט (0.005-1 M, pH 6-8). בהתחשב בעובדה 1-2 μl נצרכים לכל nanoflow נימי, אנו מציעים 10-20 μl כמו נפח מינימלי, כדי לאפשר אופטימיזציה של תנאי MS.
חלק 1: רכישת ספקטרום יון ניידות ספקטרומטריית מסה
מ '/ z | לשכון (%) | כבש (%) |
960 | 10 | 20 |
3200 | 30 | 40 |
10667 |
מקור | מלכודת | IMS | להעביר | |
RF אופסט | 450 | 380 | 380 | 380 |
RF Gain | 0 | 0 | 0 | 0 |
הגבל RF | 450 | 380 | 380 | 380 |
חלק 2: הקרנת תנאי הניסוי כדי להבטיח ניידות מדידות של מבנים מקומיים
כדי להשיג פתרון מאוד פסגות MS, קומפלקסים חלבונים מופעלים לעתים קרובות בתוך ספקטרומטר מסה, כדי לקדם את הפשטת מים שיורית ורכיבים חיץ 11. עם זאת, אם את אנרגיית הפעלה מוגברת מעבר לערך סף, חלקי התגלגלות יכול להיגרם להרכיב מדינות ביניים מספר 12, אשר צפויים להתאים את מבנה יליד פתרון של מדינה, (איור 3A-C). כתוצאה מכך, שיא הזמן להיסחף יכול להיות מוזז והרחיב, המשקף את האוכלוסייה הטרוגנית של פרש מבנים.
על מנת לקבל זמן להיסחף נתונים בקנה אחד עם פתרון שלב מבנים, חיוני בזהירות לשלוט במתחים המשמשים מאיץ יונים, לפני ההפרדה IM. יתר על כן, עבור MS רזולוציה גבוהה עדיף להגדיל את העברה ולא מתח מלכודת. כאשר המכשיר ממוקם IM, הראשון, ואחריו האזור העברת מנתח TOF, ומכאן, הפעלת כדלקמן המדידה צ'אט יונים נותר ללא פגע, ואילו דיוק MS יכול להיות מוגברת.
כדי לאמת כי רכישת נתונים מתבצעת בתנאים לשמור על מבנה הילידים של המתחם, מומלץ כי הנתונים שיירשמו על פני טווח של תנאי הניסוי פתרון, ולא על פי אחד, ערכה אופטימיזציה של פרמטרים:
חלק 3: בדיקת ההתאמה בין ערכי הזמן להיסחף חתך אזורי
בניגוד למדידות IM הקונבנציונלית, שבה הזמן נמדד בערכים להיסחף קשורים באופן ליניארי על Ω, במערכת IMS T-גל, באזור החתך לחצות מוגדר על ידי גישה כיול. כך, במקום מדידה מוחלטת, מתאם מעריכי היחסי שנוצר בין הזמנים להיסחף נמדד Ω 1,13:
כאשר t D זה הזמן להיסחף נמדדת, ו-X הוא קבוע פרופורציה כי ניתן להפיק עקומת כיול. כיול היא לבצעעורך ידי מדידת הזמנים סחיפה של יונים עם Ω ידוע (נמדד מניסויים IM קונבנציונלי).
חלק 4: הגדרת זמן ערכים להיסחף
תוכנה דרושה: MassLynx ו Driftscope (ווטרס).
חלק 5: תוצאות נציג
באיור 1. ייצוג סכמטי של המכשיר Synapt HDMS המציין את הפרמטרים העיקריים של הרכישה מתכונן IMS-MS. פרמטרים ניסיוני המשמש IM-MS מדידות מסומנים בהתאם למיקום שלהם בתוך המכשיר. אלומת יונים היא בצבע אדום, ואת הלחץ בכל אזור המיועד בעזרת קוד צבע. הפאנל בתחתית ממחיש את הפוטנציאל שיפוע לאורך המכשיר ואת ההבדלים פוטנציאל להגדיר את מלכודת התנגשות העברת אנרגיות, כמו גם את הפוטנציאל הטיה. כל פוטנציאלים לקריאה הגב מפנה למתח קיזוז סטטי אשר מוגדר בדרך כלל 120V.
איור 2. הגעת ניידות יון זמן הפצות לחלבון Gβυ.
א מהירות גבוהה T-מוביל גל הפצה צר של הפרופיל הזמן להיסחף. העלילה מתאר את זמן ההגעה ההפצה של 16 + (אדום), 15 + (ירוק), 14 + (כחול), ו - 13 + (מג'נטה) קובע תשלום, כמו גם את הפרופיל הזמן הכולל סחיפה (בשחור) של חלבון G βυ.
ב להיסחף אופטימיזציה זמן ספקטרום עם צורה גאוס חלקה שיא. צבע תוויות דומות כמו.
ג 'רול על "אפקט, אשר מתרחשת כאשר הפעם נלקח יונים לעבור את התא הניידות היא איטית יותר מאשר המרווח בין הזרקות של מנות חדשות יון לתוך המכשיר. כתוצאה מכך, השיא המורחבת זמן להיסחף מופיע בתחילת הספקטרום. אפקט זה ניתן למנוע על ידי הגדלת גובה T-גל, ולהפחית טי גל מהירות ולחץ IMS.
"אדוות" ד מלאכותית נגרמות כאשר גל ה-T העברת מהירות ותדירות דחפן מסונכרנים באופן חלקי. השפעה זו ניתן להתגבר על ידי התאמת או תדירות דחפן או טי גל מהירות העברה.
איור 3. ההשפעה של הפעלת יון ותנאי denaturing חלקית על ספקטרום IM-MS של המוגלובין. מגרש הזמן להיסחף לעומת m / z עבור המתחם המוגלובין tetrameric, באמצעות בתמיסה מימית של 10 mM אמוניום אצטט (pH = 7.6) (A, C) ועל תוספת של חומצה אצטית 0.1% (B). נתונים רכשה באמצעות התנגשות מלכודת אנרגיה מתח של 13 V (A, B) ו - 35 וולט (ג) על אף בכל שלושת הפאנלים ספקטרום המונית (מוקרן על החלק העליון) נראה דומה, עם סדרה תשלום tetrameric מרוכז ב 4000 מ '/ z, הזמן להיסחף פרופיל (מוקרן על שני הצדדים) שונה (חלוקת סך הזמן להיסחף הואבשחור, פרופיל 16 + הוא בצבע אדום). בפעם להיסחף יותר של המדגם מפוגל חלקית, שהושגו B, הגז שלב יונים מופעל, שהושג ב-C, מעיד על מידה מסוימת של התגלגלות. תצפית זו ממחישה כי למרות המוני נמדד מתאים מורכב שלם, מבנה הפתרון שלה מופרת. כתוצאה מכך, בקרה קפדנית של תנאי הניסוי הנדרש.
איור 4. על ידי יצירת עקומת כיול, מדידות להיסחף זמן ההתנגשות בחתכים יכול להיות מתואמים.
א נמדד הזמן להיסחף הערכים של מדינות תשלום מרובות של סוסים ציטוכרום C (עיגולים), הלב סוס מיוגלובין (משולשים) ו שור היוביקוויטין (ריבועים) היו זממו נגד ערכי הספרות Ω תיקנה המדינה הן יון תשלום מסה מופחתת. מתאים התשואות פונקציה לינארית המתאים: ln (Ω C) = Xln (t ד ') + A. גורם מעריכי נקבע (X), מתאים שנקבע קבוע (א), מקדם המתאם מוצגים על המגרש שנרכש עבור נתונים במהירות T-גל של 350 m / s, וגובה הגלים סטטי של 11 ו-B. היסטוגרמה של הפצות מקדם המתאם המתקבל 10 ניסויים כיול רצופים.
חלבון מדגם / פרמטרים טכניים | GluFibrino- פפטיד מונומר 1.6 kDa | מיוגלובין מונומר 17 kDa | המוגלובין tetramer 67 kDa | Transferrin מונומר 80 kDa | GroEL 14-mer 801 kDa |
לחץ גיבוי, mbar | 4.4 | 5.0 | 5.1 | 5.1 | 6.5 |
לחץ מלכודת, mbar | 1.6x10 -2 | 2.4x10 -2 | 2.4x10 -2 | 2.6x10 -2 | 2.8x10 -2 |
לחץ IMS, mbar | 4.4x10 -1 | 4.4x10 -1 | 4.4x10 -1 | 4.4x10 -1 | 4.2x10 -1 |
קונוס מתח דגימה, V | 46 | 80 | 80 | 80 | 118 |
הפקת מתח חרוט, V | 1.7 | 1 | 1 | 1 | 3 |
הטיה מתח, V | 20 | 20 | 25 | 25 | 50 |
התנגשות אנרגיה מלכודת, V | 20 | 15 | 15 | 15 | 80 |
התנגשות העברת אנרגיה, V | 5 | 12 | 12 | 12 | 15 |
טבלה 1. תנאי הניסוי בשימוש לניתוח מקרומולקולות.
תקן חלבון | Mass מולקולרית (מ) | חיובים (z) | מ '/ z | התנגשות חתך (ב 2) |
ציטוכרום C | 12213 | 10 | 1222.3 | 2226 |
11 | 1111.3 | 2303 | ||
12 | 1018.8 | 2335 | ||
13 | 940.5 | 2391 | ||
14 | 873.4 | 2473 | ||
15 | 815.2 | 2579 | ||
16 | 764.3 | 2679 | ||
17 | 719.4 | 2723 | ||
18 | 679.5 | 2766 | ||
מיוגלובין | 16952 | 11 | 1542.1 | 2942 |
12 | 1413.7 | 3044 | ||
13 | 1305.0 | 3136 | ||
14 | 1211.9 | 3143 | ||
15 | 1131.1 | 3230 | ||
16 | 1060.5 | 3313 | ||
17 | 998.2 | 3384 | ||
18 | 942.8 | 3489 | ||
19 | 893.2 | 3570 | ||
20 | 848.6 | 3682 | ||
21 | 808.2 | 3792 | ||
22 | 771.6 | 3815 | ||
היוביקוויטין | 8565 | 8 | 1071.6 | 1442 |
8 | 1071.6 | 1622 | ||
9 | 952.7 | 1649 | ||
10 | 857.5 | 1732 | ||
11 | 779.6 | 1802 |
טבלה 2. חלבונים Calibrant ולחצות התנגשות הערכים שלהם הסעיפים נקבע על ידי קונבנציונאלי measurments IMS 14.
התקנים | חברה | מספר קטלוגי |
Synapt HDMS-32K RF גנרטור | ווטרס בע"מ | |
P-97-Flaming בראון micropipette חולץ | סאטר מכשירים | P-97 |
גמגום coater | מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים | EMS550 |
המשקפת מיקרוסקופ | ניקון | |
ריאגנטים | חברה | מספר קטלוגי |
אמוניום אצטט | סיגמא אולדריץ | סיגמא, A2706 |
CSI 99.999% | סיגמא אולדריץ | אולדריץ', 203033 |
מתנול | סיגמא אולדריץ | Fluka, 34966 |
חומצה אצטית | פישר סיינטיפיק | AC12404 |
סוסים מיוגלובין (מהלב סוס) | סיגמא אולדריץ | M1882 |
סוסים ציטוכרום C (מהלב סוס) | סיגמא אולדריץ | C-2506 |
שור היוביקוויטין (מתאי דם אדומים) | סיגמא אולדריץ | U6253 |
המוגלובין | סיגמא אולדריץ | H2625 |
גז | תגובות | |
חנקן, 99.999% טהור | 8 מטר מעוקב גליל | |
ארגון, 99.999% טהור | 8.8 מעוקב meterscylinder |
לוח 3. ריאגנטים וציוד.
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר להגדיר את לחצות קטע ההתנגשות של חלבונים או קומפלקסים חלבונים עם מבנה בעל שלוש ידועים ממדי, במטרה לספק מידע על הצורה הכללית שלהם, אריזה למקטע ו טופולוגיה. לשם כך פעם לחצות התנגשות ערכים סעיף מתוארים יש צורך להמיר את הערכים הללו כדי פרטים מבניים. תהליך זה דורש מאמצים נוספים ניסיוניים כמו גם ניתוח חישובית, אשר דנו בקצרה להלן.
ראשית, מומלץ לנתח חלבונים או קומפלקסים חלבונים עם מבנים ידועים. מדידות אלה יכולים לספק בקרת איכות שימושי של המתודולוגיה ויאפשר הערכת הדיוק של הפרמטרים הרכישה על ידי השוואת התיאורטי נמדד בערכים Ω. אזורים התיאורטי חתך צלב ניתן לחשב מתוך המבנה הגבישי קואורדינטות באמצעות תוכנת MOBCAL 15,16, המהווה מקור פתוח תוכנה FORTRAN מבוסס קוד המאפשר עריכת בהתאם לצרכי המפעיל. עבור מפעיל חישובים כאלה הוא נדרש לשנות את התוכנית כך שמספר איטרטיבי חישובים שבוצעו לכל מבנה קלט הוא גדל וזה לתאם קבצים המכילים מספר גדול של אטומים מתקבלים 1.
אסטרטגיה IM-MS להגדרת הסדרים טופולוגי של יחידות משנה בתוך multicomponent אסיפות הוצע לאחרונה 4,6. השיטה כרוכה ניטור של המסלולים דיסוציאציה של מכלולים חלבון לרכיבים קטנים יותר. דיסוציאציה זו מושגת באמצעות התאמה מבוקרת של התנאים שלב פתרון, אשר מעורר הפצה של subcomplexes רעיוני של "אבני הבניין" של מכלולים. מדידה בו זמנית של ערכים Ω של המתחם שניהם שלמים ומוצרי פירוק יוצרת מגבלות מבניות אשר משמשים לחישוב המודלים טופולוגי של קומפלקסים חלבונים. הנחת היסוד הבסיסית במתודולוגיה זו היא כי subcomplexes שנוצר לשמור אישורים מקומיים כמו שלהם, ואכן מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי המבנה פתרון של מוצרי פירוק נשמרת ואין התארגנות מרכזי פתרון או שלבים גז התרחשו 4,6.
השלב האחרון במשימה של מבנה הרביעון לגז שלב יונים חלבון מורכב מתאים הצלב התנגשות ערכים סעיף מודלים מחשב. גישות מידול מועסקים על מנת לחקור את הסדרים שונים טופולוגי אפשרית של יחידות משנה שלהם ואת הערכים סיליקו Ω מחושבים לעומת אלה ניסיוני. נכון לעכשיו רק גישות חישוביות כמה משמשים, כמו שיטת גס גרגר spheretype המדמה את הקוטר של יחידות משנה 1,8. ככלל, תחום זה נמצא עדיין בשנים הראשונות שלה התפתחות נוספת נדרשת כדי להפוך את הגישה הזו גנריות, והיא חלה על מגוון רחב של קומפלקסים.
המחברים מודים לחברי הקבוצה שרון סקירה ביקורתית שלהם, על תרומתם כתב היד. אנו אסירי תודה על התמיכה של תוכניות מורשה ו ביכורה, הקרן הלאומית למדע (מענק מס '1823-1807 ו - 378/08), יוסף כהן מרכז מינרבה לחקר Biomembrane, עמיתי משפחת צ'ייס תכנית מדענים בניו, אברהם וסוניה Rochlin קרן; האמון משפחת וולפסון הצדקה; הלן מילטון א קימלמן המרכז מבנה Biomolecular ו העצרת; הנדל"ן של שלמה סבין Beirzwinsky; Meil דה בוטון Aynsley, וקארן סיאם, בריטניה.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved