Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ציטוכרום c אוקסידאז / נתרן דהידרוגנז (COX / SDH) פעמיים תיוג השיטה מאפשרת להדמיה ישירה של המיטוכונדריה אנזים ליקויים בדרכי הנשימה טרי קפוא סעיפים רקמות. זוהי טכניקה פשוטה histochemical שימושי חוקרת מחלות מיטוכונדריאליות, הזדקנות, הזדקנות בהפרעות הקשורות.

Abstract

דנ"א מיטוכונדריאלי (mtDNA) ליקויים הם גורם חשוב של המחלה וייתכן ביסוד הזדקנות מהזדקנות 1,2 שינויים. התיאוריה המיטוכונדריה של הזדקנות מציע תפקיד מוטציות mtDNA, אשר יכול לשנות הומאוסטזיס bioenergetics ותפקוד התא, בתהליך ההזדקנות 3. שפע של עדויות כבר מלוקט תמיכה 1,4 זה בתיאוריה, להיות דוגמה המוטטורי mtDNA עכבר 5, אך את התפקיד המדויק של הנזק mtDNA בהזדקנות הוא לא הבין לגמרי 6,7.

התבוננות את הפעילות של אנזימים הנשימה היא גישה פשוטה לחקירת תפקוד המיטוכונדריה. קומפלקס IV, או ציטוכרום אוקסידאז ג (COX), חיוניים לתפקוד המיטוכונדריה. יחידות משנה קטליטי של COX מקודדים על ידי mtDNA חיוניים להרכבה של המתחם (איור 1). לפיכך, סינתזה לתפקוד תקין והם מבוססים במידה רבה על mtDNA שלמות 2.למרות מתחמי נשימתיות אחרות יכול להיחקר, מתחמי IV ו-II הם נוחים ביותר לבחינה histochemical 8,9. קומפלקס II, או דהידרוגנז succinate (SDH), מקודד כולו על ידי ה-DNA גרעיני (איור 1), ואת הפעילות שלה הוא בדרך כלל לא מושפעים לקויי mtDNA, למרות עלייה עשויים להצביע biogenesis המיטוכונדריה 10-12. MtDNA לקויי שנצפתה מחלות מיטוכונדריאליות, ההזדקנות, מחלות הקשורות לגיל מוביל לעתים קרובות נוכחות של תאים עם פעילות COX נמוך או נעדר 2,12-14. למרות פעילות COX ו SDH יכול להיחקר בנפרד, שיטת רציפים פעמיים תיוג 15,16 הוכיח את יתרון באיתור תאים עם תפקוד המיטוכונדריה 12,17-21.

רבים מן החוקות אופטימלי של assay נקבעו, כגון ריכוז המצע, acceptors האלקטרון / תורמים, נושאות אלקטרון ביניים, ההשפעה של ה-pH, ו-t התגובהIME 9,22,23. 3,3 '-diaminobenzidine (DAB) הוא תורם אלקטרון יעיל ואמין 22. בתאים עם תפקוד COX, המוצר פולימר חום indamine יהיה להתמקם cristae המיטוכונדריה ו להרוות תאים 22. תאים אלה עם COX מתפקדת ולכן לא יהיה רווי ידי DAB המוצר, המאפשר הדמיה של פעילות SDH על ידי הפחתה של nitroblue tetrazolium (NBT), acceptor האלקטרון, למוצר formazan כחול סוף 9,24. ציטוכרום C ו succinate מצעים נתרן מתווספים לנרמל את רמות אנדוגני מלאה בין חולה / מוטציה רקמות 9. Catalase נוסף כאמצעי זהירות, כדי למנוע זיהום אפשרי התגובות מפעילות peroxidase 9,22. Methosulfate Phenazine (PMS), נושאת אלקטרון ביניים, הוא משמש יחד עם אזיד הנתרן, מעכב שרשרת הנשימה, כדי להגביר את היווצרותם של תוצרי התגובה הסופית 9,25. למרות זאת להודיעation, כמה פרטים קריטיים המשפיעים על התוצאה של assay זה פשוט נאה, בנוסף שולטת הספציפיות התקדמות הטכניקה, טרם הציג.

Protocol

1. רקמות כהכנה cryosectioning

  1. הקורבן בעלי חיים על ידי פריקה או עריפת ראש או צוואר הרחם, על פי היתר מוסרי זמין.
  2. במהירות לאסוף רקמות עניין (למשל. במוח), במהירות הקפאת קרח יבש (רקמות עשויה לדרוש הקפאת isopentane או פרופאן מקורר עם חנקן נוזלי כדי להשיג מורפולוגיה אופטימלית). רקמות חנות בנייר אלומיניום ב -80 ° C עד מוכן סעיף.
  3. הטמע הרקמה הקפואה לקראת cryosectioning.
  4. איסוף של 14 מיקרומטר סעיפים cryostat ב -21 ° C (ייתכן שיהיה עליך להתאים הטמפרטורה ± 1-2 ° C). להפשיר חלקים על שקופיות באמצעות בלוק חימום, בלי שקופיות חנות coverslipping ב -20 ° C עד מוכן לשימוש.

2. COX histochemistry

  1. אפשר שקופיות לייבוש בטמפרטורת החדר במשך שעה 1. שים שקופיות בתא שקופיות הכתמה עם נייר סינון רטוב, חתוך לרצועות. כדי להשיג consistenתוצאות לא בכל ניסוי, מומלץ לעבד עד עשר שקופיות הניסוי כדי למזער את העיכובים זמן.
  2. הכן תחת ברדס כימיים 1X DAB, 100 מיקרומטר ציטוכרום C ב 0.1 M PBS pH = 7.0. וורטקס במהירות.
  3. הוסף 2 מיקרוגרם שור Catalase (2 מיקרוגרם מ"ל -1 או כ 4 IU מ"ל -1). מערבבים היטב על ידי vortexing לשבור את כל גרגרי Catalase.
  4. החלת 150-200 μL של המדיום הדגירה להחליק כל, להשתמש קצה פיפטה כדי להתפשט באופן שווה על כל חלקי.
  5. דגירה השקופיות במשך 40 דקות ב 37 ° C.
  6. הסר פתרון עודף השקופיות. לשטוף שקופיות 4 פעמים, 10 דקות בכל פעם, ב 0.1 M PBS pH = 7.0.
  7. חזור שקופיות קאמרית השקופית מכתים עם רצועות נייר רטוב.

3. SDH histochemistry

  1. הכן מתחת למכסה המנוע כימי 1.5 מ"מ NBT, נתרן 130 mM succinate, PMS 0.2 מ"מ, 1.0 mM אזיד הנתרן ב 0.1 M PBS pH = 7.0. קח זהירות כדי להגן עלתסמונת קדם וסתית מן האור. וורטקס במהירות.
  2. החל 150-200 μL של המדיום הדגירה להחליק כל, להשתמש קצה פיפטה כדי להתפשט באופן שווה על כל חלקי.
  3. דגירה השקופיות במשך 40 דקות ב 37 ° C.
  4. הסר פתרון עודף השקופיות. לשטוף שקופיות 4 פעמים, 10 דקות בכל פעם, ב 0.1 M PBS pH = 7.0.
  5. מייבשים את השקופיות 2 דקות בריכוזים הבא של אתנול: 70%, 70%, 95%, 95%, 99.5%. לאחר מכן לאפשר 10 דקות בשלב 99.5% נוספים.
  6. המקום שקופיות קסילן במשך 10 דקות. הר עם Entellan ו coverslip. אפשר השקופיות להתייבש שעות הלילה, או לפחות 1-2 במקום מאוורר.

4. קביעת תפקוד המיטוכונדריה

  1. הסכום של תפקוד המיטוכונדריה הוא הצביע על ידי כמות מכתים כחול הסלולר. כדי למחצה לכמת את הסכומים הללו, מגלשות צריך להיות מקודדים דמיינו תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. חצי כימות צריכה להתבצע על עיוור בסיס באמצעות סולם, למשל 0-4 (0, ללא כתמים כחולים, 4, רק כתמים כחולים). עדיף לבצע סוג זה של כימות למחצה על כמה סעיפים מנושא מסוים / חיה כדי לחשב ערך ממוצע לכל נושא / בעלי חיים.
  2. סטטיסטיקה צריכה להתבצע באמצעות בדיקת אי - פרמטריים, כגון מאן ויטני, או Kruskal-Wallis.

5. סגוליות בקרות מתאימות

  1. עבור פקדים סגוליות פעילות COX, חזור "COX histochemistry" צעדים, ולהוסיף 2.5 mM אזיד הנתרן, בדרכי הנשימה מסוף מעכב שרשרת.
  2. עבור פקדים סגוליות לפעילות SDH, חזור "SDH histochemistry" צעדים עם הסרת succinate נתרן תוספת של malonate 50 מ"מ, מעכב תחרותי של SDH.
  3. לשטוף ו מייבשים חלקים בסדרה אתנול, ולאחר מכן לטעון coverslip את השקופיות כפי שמתואר צעדים 3.4-3.6.

6. נציג תוצאות:

אוהל "> התוכנית הכוללת של COX / SDH פעמיים תיוג assay histochemical מתוארת באיור 2. דוגמאות מייצגות של histochemistry COX / SDH פעמיים תיוג מתאים בסעיפים המוח של wild-type ו הזדקנות בטרם עת עכברים mtDNA המוטטורי מוצגים באיור 3. מכתים חום כהה wild-type עכברים (איור 3, פאנל משמאל) הראו פעילות נורמלית COX. תאים עם ליקויים שרשרת הנשימה, שמסומן על ידי צביעת הכחול, נחשפו 12 בן שבוע עכברים mtDNA המוטטורי, ועל ליקויים אלה הפכו נפוץ יותר כמו עכברים mtDNA המוטטורי בגילאי עד 46 שבועות (איור 3, מרכז הפאנל מימין).

דוגמאות של תיוג כפול הולם COX / SDH בסעיפים המוח מפני wild-type עכברים בשל תיוג COX מספיק מוצגים באיור 4. זמן הדגירה לקוי להפגנה של פעילות COX, או לצמצם את הזמינות של חמצן מולקולרי על ידי coverslipping השקופית במהלך הדגירה, הביא בתצהיר מופחת של מגיבים DABמוצר יון, ובכך אפשרה היווצרות של המוצר formazan כחול במהלך סוף הדגירה SDH.

פעילות COX ו SDH יכול להיות גם נחקר בנפרד (איור 5, שמאל ומרכז), אולם תיוג סדרתית מסייעת לזיהוי תאים עם ליקויים COX, עקב היווצרות של המשקע הכחול במהלך הדגירה SDH (איור 3, מרכז מימין). בקרות ספציפיות לפעילויות קוקס SDH יכול להעשות גם (איור 5, מימין).

figure-protocol-5903
באיור 1. מיטוכונדריאלי מכלולים הנשימה IV. שרשרת הנשימה במיטוכונדריה ממוקם בתוך הממברנה הפנימית כולל חמישה מתחמי. מטרת שרשרת הנשימה הוא להעביר אלקטרונים מורכבים אני אל IV ותוך כדי כך הוא יוצר מפל פרוטונים דרך הממברנה הפנימית בשימוש על ידי V מורכבות (ATPase) כדי לייצר ATP. Represe משושים האדוםיחידות משנה nt המקודדים על ידי mtDNA. משושים לבנים מייצגים יחידות משנה המקודדים על ידי הדנ"א הגרעיני (שים לב קומפלקס II מקודד לחלוטין הגנום הגרעיני). לפיכך, מוטציות בגנום המיטוכונדריאלי יכול לגרום לבעיות של שרשרת הנשימה עקב מוטציות יחידות משנה של מתחמי שרשרת הנשימה.

figure-protocol-6616
באיור 2. תרשים זרימה של assay COX / SDH פעמיים תיוג histochemical. מנתחים את האיברים של עניין, במהירות להקפיא את רקמות על קרח יבש, ולאחסן אותם ב - 80 ° C. איסוף חלקים cryostat ולשמור על - 20 ° C עד השימוש. אפשר סעיפים לאוויר יבש בטמפרטורת החדר במשך שעה 1. הכן את המדיום הדגירה של histochemistry COX, ולהחיל אותו על שקופיות דגירה במשך 40 דקות ב 37 ° C. לשטוף את הסעיפים PBS 4 פעמים למשך 10 דקות כל אחד לשטוף. הכן את המדיום הדגירה של histochemistry SDH, ולהחיל אותו על SLIדה, ועל דגירה שוב 37 מעלות במשך 40 דקות שטפו את החלקים שוב PBS, מייבשים בסדרה אתנול, ולאחר מכן לטעון coverslip השקופיות. COX / SDH פעמיים שכותרתו קטעים מוכנים להציג תחת מיקרוסקופ שדה בהיר בתוך 1-2 שעות.

figure-protocol-7443
באיור 3. דוגמאות מייצגות של COX / SDH פעמיים תיוג. חלקים מן המוח wild-type ו הזדקנות בטרם עת עכברים mtDNA המוטטורי תויגו ברצף לפעילויות COX ו - SDH. (סרגל קנה מידה:. 200 מיקרומטר) Normal פעילות COX (מסומנת בצבע חום כהה) הוצגה בהיפוקמפוס של wild-type עכברים (משמאל). ליקויים COX (מסומנת בצבע כחול) נחשפו בהיפוקמפוס מעכברים mtDNA המוטטורי (מרכז וימין). חלה ירידה נוספת בפעילות COX על ידי 46 שבועות של גיל בעכברים mtDNA המוטטורי, דבר המצביע על החרפה נרחב של בעיות בתפקוד שרשרת הנשימה. צפו מיטותפקוד לקוי chondrial ב mtDNA המוטטורי עכברים 12 נגרמת על ידי רמות גבוהות של mtDNA מוטציות נקודה, כמו גם רמות גבוהות של מחיקות ליניארי 5.

figure-protocol-8246
איור 4. דוגמאות לא הולם COX / SDH פעמיים תיוג. חלקים מן המוח wild-type עכברים תויגו ברצף לפעילויות COX ו - SDH. (סרגל קנה מידה:. 200 מיקרומטר) פעמים הדגירה לקוי (10 ו - 25 דקות) להפגנה של פעילות COX הביא בתצהיר מופחת של המוצר התגובה חום DAB, לעומת זמן של 40 דקות הדגירה (שמאל מרכז). פעמים הדגירה מתקצר אפשרה היווצרות של המוצר formazan כחול במהלך סוף הדגירה SDH, מטעה המצביע על נוכחות של תאים עם ליקויים COX. Coverslipping את השקופיות במהלך הדגירה COX גם הביאה להיווצרות בתצהיר מדויק של מגיבים DABיון מוצר (מימין).

figure-protocol-8914
איור 5. Ndividual COX אני וסימון SDH ושליטה סגוליות. חלקים מן המוח wild-type עכברים תויגו בנפרד עבור פעילויות COX ו - SDH, שמסומן על ידי צבע חום כהה בצבע כחול, בהתאמה (שמאל מרכז). למרות פעילות COX ו SDH יכול להיות מתויג בנפרד, תיוג רציפים הוכיח את יתרון באיתור תאים עם תפקוד המיטוכונדריה. דוגמה של פקד סגוליות לפעילויות קוקס SDH במוח של עכבר wild-type הראו היעדר תיוג (מימין). (סרגל קנה מידה:. 200 מיקרומטר)

Discussion

השיטה המשולבת COX / SDH histochemical מאפשרת ויזואליזציה של תאים בעלי תפקוד המיטוכונדריה. טכניקה זו, עם מחקרים מוקדמים שראשיתה 1968, נותר פופולרי, עם הרבה בהתחשב בכך את "תקן הזהב" לזיהוי מחלות מיטוכונדריאליות בחולים 14,19,26,27. עכשיו זה משמש לעתים קרובות כדי לחקור mtDNA מוטצ?...

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להזדקנות (AG04418), המכון הלאומי לשימוש בסמים, המכון הלאומי לבריאות, קרולינסקה תוכנית Institutet שותפויות בוגר, קרולינסקה Institutet, שוודית מועצת המחקר, כוח המוח שוודית, קרן המוח שוודית. תודות רבות Mattias קרלן, ד"ר ג'וזפה Coppotelli לתמיכה יצירתי עם איור 1 ו - 2, בהתאמה; קארין Pernold לקבלת סיוע טכני; ואת בני הזוג. בארי ג'יי הופר, לארס אולסון, נילס, גוראן לארסון עבור עצות מועילות דיון רב.

Materials

שם מגיב חברה מספר קטלוגי הערות (אופציונלי)
קרח יבש AGA גז AB לחסום טופס
Isopentane (2-methylbutane) Sigma-Aldrich 277258
CAS: 78-78-4
Cyrostat פתרון הטבעה סאקורה Finetek רקמות Tek 4583
Cryostat Microm Microm דגם HM -500
שקופיות Thermo Scientific פרוסט סופר פלוס
Menzel גלזר
J1800AMWZ
כיסוי משקפיים
בורוסיליקט זכוכית 		VWR הבינלאומי 16004-098 24 x 50 מ"מ
מסנן נייר Munktell סינון AB איכות: 1350
מאמרמספר: 242 001 		430 x 430 מ"מ
3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) Sigma-Aldrich סיגמא מערכת התשתית נוזלי, D7304
ציטוכרום C (סוג III, מהלב סוסים) Sigma-Aldrich C2506
CAS: 9007-43-6
שור Catalase (מהכבד) Sigma-Aldrich C9322
CAS: 9001-05-2
Nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma-Aldrich N6876
CAS: 298-83-9
נתרן succinate Sigma-Aldrich S2378
CAS: 6106-21-4
Phenazine methosulfate (PMS) Sigma-Aldrich P9625
CAS: 299-11-6 		PMS הוא רגיש לאור. מגן מפני אור.
אזיד הנתרן Sigma-Aldrich S8032
CAS: 26628-22-8
קסילן VWR הבינלאומי EM-XX0060-4
Entellan VWR הבינלאומי 100503-870
Malonate
(חומצה Malonic) 		Sigma-Aldrich M1296
CAS: 141-82-2

References

  1. Larsson, N. G. Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging. Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).
  2. Cottrell, D. A. Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).
  3. Harman, D. The biologic clock: the mitochondria. J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).
  4. Wallace, D. C. Mitochondrial genetics - a paradigm for aging and degenerative diseases. Science. 256, 628-632 (1992).
  5. Trifunovic, A. Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase. Nature. 429, 417-423 (2004).
  6. Ameur, A. Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins. PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).
  7. Safdar, A. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).
  8. DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C. Mitochondrial myopathies. Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985).
  9. Old, S. L., Johnson, M. A. Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle. Histochem. J. 21, 545-555 (1989).
  10. Chaturvedi, R. K. Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington's disease. Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).
  11. Edgar, D. Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice. Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).
  12. Ross, J. M. High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).
  13. Crugnola, V. Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis. Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).
  14. Nonaka, I. Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency. Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).
  15. DiMauro, S. Mitochondrial encephalomyopathies. Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990).
  16. Bonilla, E. New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies. Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).
  17. Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle. Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).
  18. Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death. Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).
  19. Gellerich, F. N. Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size. Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).
  20. Larsson, N. G. Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice. Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).
  21. Ekstrand, M. I. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).
  22. Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB). J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).
  23. Dubowitz, V., Brooke, M. Muscle Biopsy: A Modern Approach. , (1973).
  24. Cottrell, D. A. Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age. Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).
  25. Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres. Histochem. J. 20, 230-243 (1988).
  26. Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle. Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).
  27. Petruzzella, V. Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243. Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).
  28. Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations. J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).
  29. Haas, R. H. The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease. Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

57COX SDHhistochemistrymtDNAmtDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved