Visualização da função respiratória mitocondrial usando Citocromo C Desidrogenase Oxidase / Succinato (COX / SDH) Histoquímica rotulagem dupla

Resumo

O citocromo c oxidase desidrogenase / sódio (COX / SDH) método duplo-rotulagem permite a visualização direta de deficiências enzimáticas mitocondriais respiratória em seções de tecido fresco congelado. Esta é uma técnica simples histoquímica e é útil na investigação de doenças mitocondriais, envelhecimento, envelhecimento e distúrbios relacionados.

Resumo

DNA mitocondrial (mtDNA) defeitos são uma importante causa de doença e pode ser a base de envelhecimento e relacionadas ao envelhecimento ^1,2 alterações. A teoria mitocondrial do envelhecimento sugere um papel para mutações do mtDNA, que pode alterar a homeostase bioenergética e função celular, no processo de envelhecimento ^3. A riqueza de evidências foram compiladas em apoio a este ^1,4 teoria, a exemplo do mtDNA modificador do mouse ^5, mas o papel preciso de mtDNA danos do envelhecimento não é totalmente compreendido ^6,7.

Observando a atividade das enzimas respiratórias é uma abordagem simples para investigar a disfunção mitocondrial. Complexo IV ou citocromo c oxidase (COX), é essencial para a função mitocondrial. As subunidades catalítica da COX são codificadas por mtDNA e são essenciais para a montagem do complexo (Figura 1). Assim, a síntese adequada e função são em grande parte com base na integridade mtDNA ^2.Apesar de outros complexos respiratórios poderiam ser investigados, Complexos IV e II são as mais passíveis de exame histoquímico ^8,9. Complexo II ou succinato desidrogenase (SDH), é inteiramente codificada pelo DNA nuclear (Figura 1), e sua atividade normalmente não é afetado por deficiência mtDNA, apesar de um aumento pode indicar biogênese mitocondrial ^10-12. O mtDNA prejudicada observado em doenças mitocondriais, envelhecimento e doenças relacionadas à idade, muitas vezes leva à presença de células com baixa ou ausente a atividade da COX ^2,12-14. Embora as atividades de COX e SDH podem ser investigados individualmente, o método duplo-rotulagem seqüencial ^15,16 provou ser vantajoso para localizar células com disfunção mitocondrial ^12,17-21.

Muitas das constituições ótima do ensaio foram determinadas, como a concentração do substrato, receptores de elétrons / doadores, intermediário portadores de elétrons, a influência do pH e de reação time ^9,22,23. 3,3 '-diaminobenzidina (DAB) é um doador de elétrons eficaz e confiável ^22. Em células com funcionamento COX, o indamine marrom produto polímero irá localizar em cristas mitocondriais e saturar as células ^22. Essas células com COX disfuncionais, portanto, não ser saturado pelo produto DAB, permitindo a visualização da atividade SDH pela redução da nitroblue tetrazólio (NBT), um receptor de elétrons, a um produto azul final formazan ^9,24. Citocromo c e substratos succinato de sódio são adicionados para normalizar os níveis endógenos entre controle e doentes / mutante tecidos ^9. Catalase é adicionado como uma precaução para evitar possíveis reações contaminação da atividade da peroxidase ^9,22. Metasulfato fenazina (PMS), uma transportadora de elétrons intermediário, é utilizado em conjunto com azida de sódio, um inibidor da cadeia respiratória, para aumentar a formação dos produtos da reacção final de ^9,25. Apesar desta informarção, alguns detalhes críticos que afetam o resultado deste ensaio seemly simples, além de controles especificidade e avanços na técnica, ainda não foram apresentados.

Protocolo

1. Preparação de tecidos para cryosectioning

1. Sacrificar o animal por qualquer deslocamento cervical ou a decapitação, em conformidade com a ética permitir disponíveis.
2. Recolher rapidamente os tecidos de interesse (por exemplo. Cérebro), e rapidamente congelar em gelo seco (tecidos podem exigir congelamento em isopentano ou propano refrigerado com nitrogênio líquido para obter a morfologia ideal). Loja de tecidos em folha de alumínio a -80 ° C até que esteja pronto para a seção.
3. Incorporar tecidos congelados em preparação para cryosectioning.
4. Coletar seções 14 mícrons criostato a -21 ° C (pode ser necessário para ajustar a temperatura ± 02/01 ° C). Seções descongelar em slides usando bloco de aquecimento, e slides loja sem lamínulas a -20 ° C até que esteja pronto para uso.

2. Histoquímica COX

1. Permitir slides para secar em temperatura ambiente por 1 hora. Coloque slides em uma câmara de corrediça mancha com papel de filtro molhado, cortado em tiras. Para obter consistenresultados t em cada experimento, recomenda-se a processo de um máximo de dez slides por experimento para minimizar os atrasos.
2. Prepare sob um capuz químico 1X DAB, 100 mM citocromo c em 0,1 M PBS pH = 7,0. Vortex rapidamente.
3. Adicionar 2 g de bovinos catalase (2 mg ml ^-1 ou aproximadamente 4 UI ml ^-1). Misturar bem em vórtice para quebrar todos os grãos de catalase.
4. Aplicar 150-200 mL de meio de incubação para cada slide, use pipeta de espalhar uniformemente em todas as seções.
5. Incubar as lâminas por 40 minutos a 37 ° C.
6. Remover excesso de solução da slides. Lavagem das lâminas 4 vezes, 10 minutos de cada vez, em 0,1 M PBS pH = 7,0.
7. Retornar slides para deslizar coloração de câmara com tiras de papel molhado.

3. Histoquímica SDH

1. Prepare sob um capuz químico 1,5 mM NBT, 130 mM succinato de sódio, 0,2 mM PMS, e 1,0 mM de azida de sódio em 0,1 M PBS pH = 7,0. Tome cuidado para proteger aPMS da luz. Vortex rapidamente.
2. Aplicar 150-200 mL de meio de incubação para cada slide, use pipeta de espalhar uniformemente em todas as seções.
3. Incubar as lâminas por 40 minutos a 37 ° C.
4. Remover excesso de solução da slides. Lavagem das lâminas 4 vezes, 10 minutos de cada vez, em 0,1 M PBS pH = 7,0.
5. Desidratar as lâminas durante 2 minutos nas seguintes concentrações de etanol: 70%, 70%, 95%, 95%, 99,5%. Em seguida, permitir que 10 minutos em uma etapa adicional de 99,5%.
6. Coloque as lâminas em xilol por 10 minutos. Montar com Entellan e lamínula. Permitir que os slides para secar horas durante a noite, ou pelo menos 1-2 em uma área ventilada.

4. Determinação de disfunção mitocondrial

1. A quantidade de disfunção mitocondrial é indicado pela quantidade de coloração azul celular. Para semi-quantificar estes valores, slides deve ser codificado e visualizados sob microscopia de campo brilhante. Semi-quantificação devem ser realizados em um cego base utilizando uma escala, por exemplo, 0-4 (0, coloração azul não; 4, apenas coloração azul). É melhor realizar esse tipo de semi-quantificação de várias seções de um determinado assunto / animal para calcular um valor médio para cada disciplina / animal.
2. Estatísticas devem ser realizados através de um teste não-paramétrico, como Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis.

5. Controles adequados especificidade

1. Para controles especificidade para a atividade COX, repita "histoquímica COX" passos e adicionar 2,5 mM de azida de sódio, um inibidor da cadeia respiratória terminal.
2. Para controles especificidade para a atividade SDH, repita "histoquímica SDH" passos com a remoção de succinato de sódio ea adição de 50 mM malonato, um inibidor competitivo da SDH.
3. Lavar e desidratar seções em uma série de etanol, e depois montar e lamínula os slides conforme descrito nas etapas 3,4-3,6.

6. Resultados representativos:

tenda "> O esquema geral dos exemplos COX / SDH duplo rotulagem ensaio histoquímico é ilustrada na Figura 2. Representante da histoquímica COX / SDH duplo rotulagem adequada no cérebro de seções do tipo selvagem e camundongos mutator prematuramente envelhecimento mtDNA são mostrados na Figura 3. A coloração marrom escuro em camundongos selvagens (Figura 3, painel da esquerda) mostrou atividade COX normal. células com deficiências da cadeia respiratória, indicada pela coloração azul, foram revelados em 12 semanas de idade ratos mutator mtDNA, e essas deficiências se tornou mais difundido como ratos mutator mtDNA idade para 46 semanas (Figura 3, centro e painel da direita).

Exemplos de inadequado COX / SDH dupla rotulagem em seções do cérebro de camundongos selvagens, devido à rotulagem COX insuficiente são mostrados na Figura 4. Tempo de incubação insuficiente para a demonstração da atividade da COX, ou reduzir a disponibilidade de oxigênio molecular pela cobertura das deslize durante a incubação, resultou em uma redução da deposição de reagir DABíon produto e, assim, permitido para a formação do produto final formazan azul durante a incubação SDH.

Atividades COX e SDH também pode ser investigado separadamente (Figura 5, esquerda e centro), no entanto, a rotulagem seqüencial é útil na identificação de células com deficiências COX, devido à formação do precipitado azul durante a incubação SDH (Figura 3, centro e à direita). Controles especificidade para COX atividades e SDH também pode ser feito (Figura 5, direita).

Figura 1. Respiratória mitocondrial Complexos IV. A cadeia respiratória mitocondrial está localizado dentro da membrana interna e inclui cinco complexos. A finalidade da cadeia respiratória é transportar elétrons do complexo I a IV e ao fazê-lo cria um gradiente de prótons através da membrana interna usada por V Complex (ATPase) para produzir ATP. Represe hexágonos vermelhosubunidades nt codificadas por mtDNA. Hexágonos brancos representam subunidades codificadas pelo DNA nuclear (note que o complexo II é completamente codificada a partir do genoma nuclear). Assim, mutações no genoma mitocondrial pode causar disfunção da cadeia respiratória devido a mutações nas subunidades dos complexos da cadeia respiratória.

Figura 2. Fluxograma do ensaio COX / SDH duplo rotulagem histoquímica. Dissecar os órgãos de interesse, rapidamente congelar os tecidos em gelo seco, e guarde-a - 80 ° C. Coletar seções criostato e manter a - 20 ° C até usar. Permitir seções para ar seco em temperatura ambiente por 1 hora. Preparar o meio de incubação para histoquímica COX, aplicá-lo à slides, e incubar por 40 minutos a 37 ° C. Lavar as seções em PBS 4 vezes por 10 minutos cada lavagem. Preparar o meio de incubação para histoquímica SDH, aplicá-la ao slides, e novamente incubar por 40 minutos a 37 ° C. Lavar as seções novamente em PBS, desidratar em série etanólica, e depois montar e lamínula os slides. A COX / SDH duplo rotulados seções estão prontos para ver brilhantes sob microscopia de campo dentro de 1-2 horas.

Figura 3. Exemplos representativos de COX / SDH dupla rotulagem. Seções do cérebro de tipo selvagem e camundongos mutator prematuramente envelhecimento mtDNA foram seqüencialmente marcados para as atividades COX e SDH. (Bar da escala: 200. Mm) a atividade da COX Normal (indicada pela cor marrom escuro) foi mostrado no hipocampo de camundongos selvagens (esquerda). Deficiências COX (indicado pela cor azul) foram revelados no hipocampo de ratos mtDNA mutator (centro e direita). Houve uma redução ainda maior na atividade da COX por 46 semanas de idade em ratos mutator mtDNA, sugerindo exacerbação da disfunção generalizada da cadeia respiratória. O mito observadodisfunção mitocondrial em ratos mtDNA mutator ¹² é causada por altos níveis de mutações pontuais mtDNA, bem como aumento dos níveis de deleções linear ^5.

Figura 4. Exemplos de inadequado COX / SDH dupla rotulagem. Seções do cérebro de camundongos selvagens foram seqüencialmente marcados para as atividades COX e SDH. (Bar da escala: 200. Mm) tempos de incubação inadequada (10 e 25 minutos) para a demonstração da atividade da COX resultou em uma redução de deposição do produto da reação DAB marrom, em comparação com o tempo de incubação de 40 minutos (esquerda e centro). Os tempos de incubação reduzidos permitiu a formação do produto final formazan azul durante a incubação SDH, enganosamente, sugerindo a presença de células com deficiências COX. Cobertura das lâminas durante a incubação COX também resultou na formação imprecisas e deposição do reagir DABíon produto (direita).

Figura 5. I INDIVIDUAIS COX e SDH rotulagem e controle de especificidade. Seções do cérebro de camundongos selvagens foram separadamente rotulado para COX e SDH atividades, indicado pela cor castanho escuro ea cor azul, respectivamente (esquerda e centro). Embora as atividades de COX e SDH podem ser individualmente rotulados, os rótulos seqüencial mostrou-se vantajosa em localizar células com disfunção mitocondrial. Um exemplo de um controle de especificidade para COX e SDH atividades no cérebro de um rato do tipo selvagem mostrou falta de rotulagem (direita). (Bar da escala: 200. Mm)

Discussão

O método de COX / SDH combinado histoquímica permite a visualização de células com disfunção mitocondrial. Esta técnica, com estudos iniciais datam de 1968, permanece popular, com muitos considerando-o "padrão ouro" para a identificação de doenças mitocondriais em pacientes ^14,19,26,27. Agora, é freqüentemente usada para investigar o envelhecimento mutação mtDNA-driven e envelhecimento distúrbios relacionados ^{12,13,18,20,21,24.} A COX / SDH método duplo-rotulagem é frequ...

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comments (opcional)
Gelo seco	AGA Gas AB	forma de bloco
Isopentano (2 metilbutano)	Sigma-Aldrich	277258 CAS: 78-78-4
Cyrostat solução incorporação	Sakura Finetek	Tissue Tek 4583
Criostato	Microm	Microm Modelo HM 500M
Slides	Thermo Scientific	Super geada Mais Menzel Glaser J1800AMWZ
Lamínulas de vidro Vidro borosilicato	VWR International	16004-098	24 x 50 mm
Papel de filtro	Munktell Filtro AB	Qualidade: 1350 ArtigoNúmero: 242 001	430 x 430 mm
Tetrahidrocloreto 3,3 'diaminobenzidina (DAB)	Sigma-Aldrich	Sigma Sistema de substrato líquido, D7304
Citocromo c (Tipo III, do coração de eqüinos)	Sigma-Aldrich	C2506 CAS: 9007-43-6
Bovina catalase (de fígado)	Sigma-Aldrich	C9322 CAS: 9001-05-2
Nitroblue tetrazólio (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876 CAS: 298-83-9
Succinato de sódio	Sigma-Aldrich	S2378 CAS: 6106-21-4
Metasulfato fenazina (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625 CAS: 299-11-6	PMS é sensível à luz. Escudo da luz.
Azida de sódio	Sigma-Aldrich	S8032 CAS: 26628-22-8
Xileno	VWR International	EM-XX0060-4
Entellan	VWR International	100503-870
Malonato (Ácido malónico)	Sigma-Aldrich	M1296 CAS: 141-82-2