בקנה מידה גדול הקלטה של ​​הנוירונים על ידי בדיקות מטלטלין סיליקון מתנהג מכרסמים

Summary

אנו מתארים שיטות הקלטה בקנה מידה גדול של יחידות בודדות מרובות פוטנציאל בתחום המקומית מתנהג מכרסמים עם בדיקות סיליקון. כונן ייצור, מצורף בדיקה לכונן ואת ההשתלה תהליכי בדיקה באים לידי ביטוי מספיק פרטים עבור שכפול קל.

Abstract

אתגר גדול במדעי המוח מקשרת התנהגות לפעילות הקולקטיבית של מכלולים עצביים. הבנה של קלט פלט יחסים של נוירונים ומעגלים דורש שיטות עם סלקטיביות מרחבי ברזולוציה הזמני המתאים לניתוח מכניסטית של הרכבים עצביים בעלי חיים מתנהגים, כלומר הקלטה של ​​דגימות גדולות representatively של נוירונים בודדים. אנסמבל ניטור של הפעילות העצבית התקדמה במידה ניכרת אצל בעלי חיים קטנים וגדולים כאחד בעל המוח, כולל בבני אדם ^1-11 בעשור האחרון. מרובת אתרים עם הקלטה מבוססי סיליקון מכשירים יעילים במיוחד הודות ליכולת ההרחבה שלהם, נפח קטן עיצוב גיאומטרי.

כאן, נתאר שיטות הקלטה נוירונים בודדים מרובים פוטנציאליים בתחום המקומית מתנהג מכרסמים, תוך שימוש זמינים מסחרית מיקרו מכונות בדיקות סיליקון עם מחוייט רכיבים אביזר. יש 2 אפשרויות בסיסיות ואו התממשקות בדיקות סיליקון preamplifiers: מעגלים מודפסים, כבלים גמישים. חברות המספקות בדיקה ( http://www.neuronexustech.com/ ; http://www.sbmicrosystems.com/ ; http://www.acreo.se/ ) בדרך כלל לספק את השירות מליטה לספק בדיקות מלוכדות מעגלים מודפסים או כבלים גמישים. כאן, אנו מתארים את ההשתלה של החללית 4-32-שוק באתר, מצורף כבל polyimide גמיש, רכוב על Microdrive מטלטלין. כל שלב בהכנת בדיקה, בנייה Microdrive ניתוח מתוארת כך משתמש הקצה יכול בקלות לשכפל את התהליך.

Protocol

1. בניית Microdrive

כל הכוננים עשויים אלמנטים בסיסיים: החלק המרגש, אשר נושא את האלקטרודה וחלק קבוע, המעוגן אל הגולגולת. Microdrive האידיאלי מאפשר נסיעה די חלקה אבל ארוכה של האלקטרודה בצעדים קטנים מרובים, הוא יציב מספיק כדי למנוע תנועה מקרית של האלקטרודה, קל לתמרן על ידי הנסיין בלי להפריע את התנהגותו של בעל חיים קטן בגודל קלים במשקל. בעקבות דרישות אלה מתחרות, חבילת כוננים שונים ליישומים שונים.

רק 4 חלקים יש צורך לבנות כונן הבסיסית שלנו: בורג שטוח פליז ראש, אגוז התאמה, גשר פלסטיק מוכנים מן הכותרת סיכה אחת בשורה ושני אישית לחתוך לוחות פליז.

1. לשבור חתיכה 3 פינים מכותרת
2. משוך בעדינות את הסיכה התיכון.
3. להגדיל את החור על ידי קידוח דרכו עם גודל התרגיל קצת # 55.
4. גזור הלקריאה באמצעות ברז 00-90.
5. חותכים שתי חתיכות מתוך צלחת נחושת.
6. להגיש את הקצוות של הצלחות עם Dremmel.
7. לקדוח חור באמצע של שני חלקים באמצעות גודל המקדח # 65.
8. להרכיב את החלקים כונן כך צלחות נחושת נוגעים הפינים. לשם כך, הכנס את הבורג באמצעות כלי נשיפה, ברציפות, צלחת נחושת, סיכת הליכי הכותרת חור, צלחת נחושת 2, ואת אגוז. הדקו את הבורג בעדינות כך הרכבה הופך יציב.
9. הלחמה סיכה מסתיים ללוחות נחושת.
10. להגיש את הקצה הבולט של הבורג.
11. לרתך את האום על הבורג. להיזהר לא לרתך את האום לצלחת פליז.
12. בדוק את התנועה של הכונן: להפוך את הבורג השעון מבחינת לרומם את הגשר מפלסטיק.

2. הכנת בדיקה סיליקון

לפני תיקון בדיקה לכונן, להוסיף בידוד נוסף באזור מליטה של ​​החללית כדי למנוע cerebrospinal נוזל (CSF) או לחות מלייצר לקצר:

1. לשקול לערבב את המרכיבים אלסטומר Sylgard ביחס 10:01.
2. באמצעות המוליך כותנה חידד, החל את Sylgard עד הסוף גבי החללית.
3. תנו לו להתייבש בתנור שחומם מראש ב 60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.

על מנת להבטיח כי האתרים הקלטה הם ללא פסולת מקום, טיפים בדיקה יש לנקות:

4. הכן דילול 4% של חומר ניקוי Contrad.
5. בואו בדיקה לטבול בחומר ניקוי על 63 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות.
6. יש לשטוף את חומר הניקוי על ידי טבילה בדיקה שוב ושוב במים מזוקקים.

לפני תיקון בדיקה על הכונן, העכבה של כל אתר ההקלטה יש לבדוק:

7. טובלים את החללית של מי מלח 0.9%, ולחבר אותו מטר עכבה. אם אתרי הקלטה יותר מדי יש עכבה שגוי, חזור על שלבים 2.4-2.6 או לשקול שימוש בדיקה שונים.כאן אנו משתמשים מודול מיזוג התנגדות של פרדריק Haer, ושות (fhc), בשילוב עם בורר ערוצים תוצרת בית. לחלופין, niPOD ידי NeuroNexus, Inc או NanoZ ידי Neuralynx, Inc מאפשר ניטור של עכבה של כל ערוצי בדיקה בו זמנית.

3. הדבקת בדיקה כדי Microdrive

1. באמצעות סכין גילוח, לחתוך חריצים מרובים לתוך הגשר כדי ליצור משטח מחוספס.
2. Appose בדיקה לגשר של הכונן. הליך זה נעשה הכי טוב תחת מיקרוסקופ ההפעלה, על ידי לחיצה על הכונן עם מהדק והתאמת בדיקה על ידי micromanipulator כך שאנקס את מקבילים באופן מושלם עם בורג הכונן. זה מבטיח כי במהלך קידום, צעד שאנקס בדיקה לתוך רקמת המוח ללא "חיתוך" דרכו. עומק מדויק של טיפים בדיקה ביחס לבסיס של הכונן יש לקבוע בשלב זה, לוקח בחשבון את עומק של מבנה היעד מפני השטח שלהגולגולת.
3. בדיקה קבועה ואז לגשר במלט אחיזה.
4. אופציונלי: המאפשר הדמיה מסלול בדיקה במוח, פתרון DiI (1-2% אתנול מדולל) יכול להיות מיושם על החלק האחורי של החללית בשלב זה.

4. מכינים את הגולגולת

לפני הניתוח, התייחסות הקרקע אלקטרודות, ואת חלקי כלוב פאראדיי על הראש, מוכנים:

1. חותכים שתי חתיכות 2 "באורך של חוטי נחושת, ואת הקצה הלחמה אחת כל חוט נחושת מבודדים מ"מ על 1.
2. באמצעות מחט, לגרד את הראש של פיסת 00-90, 1 1/8 "בורג פלדה אל חלד הלחמה של חוט נחושת אליו. הלחמה כאלה חלד הקרקע פלדה עם הברגה אלקטרודות דורש השטף המתאים (למשל, N-3 לכל מטרה השטף של La-CO) בטמפרטורות גבוהות קצה הלחמה. בזהירות למנוע הלחמה לזרום לתוך החריץ של בורג. זה ישמש האלקטרודה לקרקע. חזור עם בורג אחר חוטי נחושת כדי להכיןאלקטרודה השוואתית.
3. חותכים חתיכות trapeziodal של רשת נחושת. חלקים אלו להרכיב כדי להגן על headstage.

מכשירי ניתוח והכנת זהים המשמשים ניתוחים רבים של בעלי חיים קטנים. הניתוח כולו מתבצע תחת הרדמה isoflurane עמוק, באמצעות תנאים אספטיים, על פי הנחיות NIH מאושרות. יש לציין כי הניתוח (מדומה) רואים בסרט זה הוא למטרות הדגמה בלבד. לצורך ניראות הצילומים המתאימים, מדרגות הכנה, אמצעי זהירות כמה ניתוחים ופרוצדורות לאחר הניתוח לא מוצגים / גלויה או לדיון.

לפני הניתוח, כל הרכיבים וציוד יש לעקר, בעקבות נהלים מתאימים (ראה הנחיות לניתוח מכרסמים הישרדות; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf~~HEAD=NNS). במהלך הניתוח, שדה סטרילי על הגולגולת מוכן ומבודדים על ידי וילונות סטריליים. בתום הניתוח, כמה אנטיביוטיקה ספקטרום רחב הואpplied מקומית רוצח ארוך טווח הכאב ניתנת לשריר (כגון עצירות, [Buprenex] 0.05 מ"ג / ק"ג). בנוסף, משכך כאבים (כגון איבופרופן) מסופק במי השתייה על כ 60 mg/kg/24 שעות במשך 5 ימים. עבור פרוצדורות כירורגיות בהרדמה של ממש, להתייעץ המקורות המתאימים ^12.

4. התקן את החיה במנגנון stereotaxic, להתגלח ולנקות את הקרקפת ^13.
5. חותכים את העור לאורך קו האמצע ולדחוף הצידה את הקרקפת. הסר את periosteum, נקי ויבש הגולגולת.
6. למדוד את המרחק בין המיקום גבחת ו למבדה, ולקבוע את x ו-y של האתר בדיקה ההשתלה בהתאם באמצעות אטלס stereotaxic ^14. סמן את האתר על ידי גירוד צלב על הגולגולת עם סכין מנתחים.
7. מקדחה הגולגולת באמצעות ראש עגול תרגיל קצת (גודל ¼) ותמיכה ברגים כונן (נירוסטה, 000-120, 1/16 ") באמצע הדרך לתוך העצם, על צלחות עצם שונים על גביND בצד הגולגולת. הברגים תספק עוגנים כדי הקסדה באופן מאובטח בונד לגולגולת.
8. לקדוח חורים מעל המוח הקטן והכנס את הקרקע אלקטרודות התייחסות שהוכנו בשלב 4.2. להקלטת פוטנציאלים שדה מקומיות (LFP), הבחירה של האתר הפניה היא קריטית. אתר זה נבחר בשל LFP cerebellar היא הקטנה מבין כל האזורים בקליפת המוח וממצאים שרירים הן מינימליות במיקום זה קו האמצע.
9. החל דנטין activator (Metabond הערכה) בעזרת מברשת קטנה על כל פני השטח של הגולגולת. יש לשטוף אותו עם מי מלח 0.9%.
10. החל דבק דנטלי (Metabond ערכת; אחר הוראות היצרן לערבוב) על הגולגולת, בזהירות כיסוי ברגים העוגן הקרקע ואלקטרודות ייחוס, אבל לעזוב את האתר ההשתלה בדיקה ברורה.
11. לאבטח את הרשת ארבע נחושת דשי (מוכן בשלב 4.3) לגולגולת. לשם כך, לחזק את הבסיס הצר של כל אחד מהם, על הצדדים הקדמי שמאלה, ימינה, ואת האחורי של הגולגולת. הנחושת ה לא צריך להיות בקשר ישיר עם העצם אבל תמיד בנפרד על ידי שכבה של מלט.

5. הכנת השטח המוח

1. שימוש קצת ראש עגול מקדחה, לקדוח מסביב לאתר ההשתלה בשלבים רבים, לעתים קרובות תוך כדי להשקות את העצם עם מי מלח.
2. מוציאים בזהירות את דש עצם להשקות את פני השטח המוח.
3. להוספת בדיקה שוק מרובה, רצועה גדולה של דורה מוסר. שני הכלים הדרושים כדי להסיר את דורה: אזמל וו מוכנים מהמחט חרק (לחלופין, microelectrode טונגסטן רגילה). לכופף את קצה המחט על ידי לחיצה על משטח קשה (למשל שקופיות מיקרוסקופ זכוכית), וצרף אותו לידית (כאן, חתיכת עצה-Q עץ, לחילופין בעל מחט microdissecting).
4. הרם את דורה עם וו, לחתוך אותו עם סכין מנתחים. טיפול מיוחד נלקח כדי למנוע נזק פיא, כלי ואת פני השטח של הניאוקורטקס. דימום קטן ניתן לפתורעל ידי השקיה מליחים. אם הדימום משמעותי מתרחש או הניאוקורטקס נפגעת בדרך כלשהי, יש לשקול הפסקת ניתוח והכנת חיה אחרת.

6. השתלת בדיקה

בשלב זה, צפיפות והכיוון של ספינות שטח קליפת המוח מוערכות בזהירות. קואורדינטות Stereotaxic צריך להיות מותאם, כי בדיקה יש לחדור למוח באזור ללא כלי גדול יותר.

להשתלה, הרכבה הכונן ניתן לערוך קליפ עם תנין קשור לבעל stereotaxic. החשיפה של פני השטח ללא הפרעה מוחית קצות החללית הן קריטיות עבור חדירה מוצלחת.

1. לאט לאט להוריד את החללית עד כ 1 מ"מ מעל ליעד המיועד, בעוד כל הזמן להשקות craniotomy עם מי מלח. להקלטת הניאוקורטקס, העצות בדיקה יורדו אל קליפת המוח כ 0.5 מ"מ והרים חזרה קרוב לפני השטח.
2. לאטום craniotomy על ידי יישום תערובת מותכת חמה של שמן שעווה פרפין באמצעות מחט (10-20 גר 'של שעווה בשמן פרפין 10 מ"ל, מחומם על 65 מעלות צלזיוס). לפני היישום, לקרר את התערובת עד 30 ° C ולבדוק את צפיפות. זה צריך להיות רך מספיק כדי לאפשר תנועה קלה בדיקה). כדי להקל על כיסוי מלא, תערובת ניתן נמס באתרו על ידי מתקרבת שעווה קשוח עם קצה cauterizer מיקרו.
3. צרף את החלק התחתון של הכונן לגולגולת במלט אחיזה, נזהר לצאת אגוז חופשי לפנות. זה הוא בעל חשיבות עליונה, כדי למנוע כל "בליטה" מקרית של הכונן בשלב זה, אחרת בדיקה יפגע קליפת המוח. לאחר נסיעה מאובטח לגולגולת, תנועה חלקה של החללית צריך להיות מאומת.
4. לחזק את החלק המחבר של החללית אל הגולגולת.

7. בונים את הראש על כלוב פאראדיי

1. להרים ולהרכיב את רשת הנחושת דשי לגליל מגן סביב החללית ו DRIיש. גליל משמש גם כמגן חשמל נגד רעש סביבתי, והממצאים גלים איטיים המיוצר על ידי שפם טעונים ב בעלי חיים מתנהגים.
2. להתאים את גובה גליל על ידי חיתוך משם חומר עודף אז רשת הנחושת הוא בגובה החלק העליון של מחבר בדיקה.
3. לרתך את החוטים מתוך התייחסות ברגים קרקעיים את הפינים המתאימים של המחבר. הלחמה גם סמוכים רשת נחושת דשי יחד כדי להבטיח המשכיות החשמל שלהם, הלחמה חוט הקרקע רשת נחושת.
4. למרוח שכבה של מלט אחיזה על רשת נחושת כדי לחזק אותו כדי למנוע מגע ישיר בין המתכת והעור של בעל החיים. לחלופין, למרוח שכבה של שרף אפוקסי כדי להמשיך ולחזק את הקסדה.
5. בדוק את התנועה של בורג הכונן.
6. תכסה את חלקו העליון של הקסדה עם חתך חתיכה מן כפפת גומי.

8. ההקלטה החיה נעה בחופשיות

1. לאחר המתאימהאכלו שלאחר הניתוח טיפול, חבר חיה למערכת ההקלטה באמצעות headstage עכבה גבוהה, קל משקל, רב גדיל כבל ultraflexible. לאזן את משקל הקסדה.
2. לבדוק את איכות ההקלטה בכל יום homecage. המיקום של אתרי הקלטה נשפטת על ידי שני דפוסי ירי היחידה ואת הצורה של פוטנציאל שדה מקומיים. מנמיכים את החללית בהדרגה על ידי סיבוב בורג במרווחים קטנים (בדרך כלל 1/8 כדי סיבוב 1/4 ליום, כלומר 35-70 מיקרומטר) עד המבנה היעד הוא הגיע.

9. נציג תוצאות

אותות אלקטרו (הפוטנציאל המקומי בתחום פעילות היחידה) משתנים בהתאם למבנה הקליט את ההתנהגות הנוכחית של בעלי חיים. איור 1 מציג דוגמאות של ערוץ 32-CA1 בהיפוקמפוס תוך כדי הקלטות החולדה בוחנת שדה פתוח. הערה בולטת 8 הרץ (תטא הלהקה) תנודה של הפוטנציאל בתחום המקומי במהלך החקירה עם לסעודerimposed להתחדד על שאנקס מרובים ואתרים (דוגמאות של קוצים שמציינים ראשי חץ). לנתח פעילות יחידת העצבית, קוצים מזוהים מיון ליחידות בודדות באמצעות ניתוח אשכולות של צורות גל שלהם ^15-16.

באיור 1. CA1 בהיפוקמפוס הקלטות של עכברוש מתנהג באמצעות מספר 4 שאנקס x 8 אתרי בדיקה סיליקון. הקלטות הן wideband ו שנדגמו ב 20 000 הרץ, המאפשר ללמוד את שתי תנודות בשדה המקומי פוטנציאליים (למשל "תטא" להקת הקצב 8 הרץ) ופעילות סימנים מחודדים העצבית.

טבלה 1. חלופות ריאגנטים וציוד המשמשים.

Discussion

סרט זה ממחיש את ההליך השתלת סיליקון עבור בדיקות בקנה מידה גדול הקלטות כרוניות בחולדה מתנהג. שלבים קריטיים כדי להבטיח הקלטות באיכות של הפעילות העצבית נובעים השבריריות של שניהם ביולוגי (רקמת המוח) ו טכניים (סיליקון בדיקה) חומרים. זהירות יש לנקוט בזמן הטיפול בדיקה כדי ל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם	סוג	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
הסיליקון בדיקה Buzsaki32, 4 ובמוטות מושחזים x 8 אתרים. אריזה: כבל גמיש פוליאמיד	חומר	NeuroNexus	בדיקה: buzsaki32 אריזה: HC32	הקלטה בדיקה
בורג נחושת עגול, 00-90 x 1/2 ברגי פליז עגול	חומר	JIMorris	R0090B500	כונן חלק
הקס אגוזים פליז, 00-90	חומר	JIMorris	N0090B	כונן חלק
פליז C260 עזה, ASTM-B36 עובי: 0.025 ", אורך: 12", רוחב: 1/2 "	חומר	חלקים קטנים	B000FMYU72	כונן חלק
מחבר כותרת, גובה 2 מ"מ, מ 'אייל, שורה אחת, straigt, 36 עמדות	חומר	Digikey	2163S-36-ND	כונן חלק
2 חלקים Sylgard אלסטומר סיליקון	חומר	Precision של מכשירים בעולם	SYLG184	כדי לבודד במיוחד בדיקה
Decon Contrad 70 בנוזל כביסה	מגיב	פישר סיינטיפיק	04-355 Decon מעבדות מספר: 1002	כדי לנקות את האתרים הקלטה
מיזוג עכבה מודול	ציוד	Fhc בע"מ	55-70-0	עכבה מטר
niPOD - 32 ערוצים	ציוד	Neuronexus	niPOD -32	עכבה מטר
מלט גריפ תעשייתי כיתה	חומר	קולק Dentsply	675,571 (אבקה) 675,572 (ממס)	גריפ לספירהment
1,1 ", dioctadecyl-3, 3,3", 3'-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט ("DiI '; DiIC18 (3))	מגיב	Invitrogen	D282	להכתים את המסלול בדיקה במוח
מכונת נירוסטה בורג פלדה, ראש איגוד, כונן מחוררת, # 00-90, 1/8 "	חומר	חלקים קטנים	MX-0090-02B	הקרקע ברגים התייחסות
חוט מגנט, 20 גר ', ניילון, פוליאוריטן ציפוי, MW80	חומר	חלקים קטנים	B000IJYRP2	הקרקע חוט התייחסות
מכונת נירוסטה בורג פלדה, ראש איגוד מחוררת דרייב, # 000-120, 1/16 "	חומר	חלקים קטנים	MX-000120-01B	עוגן ברגים
N-3 כל נוזלי שטף מטרה	מגיב	La-Co (Markal)	23512	מאפשר לרתך נירוסטה
MicroGrid Precision מורחב נחושת	חומר	Dexmet	3 CU6 FA-050	נחושת רשת עבור על ראש כלוב פאראדיי
C & B-METABOND מהר! מלט מערכת - דנטין Activator	חומר	Parkell	S380
C & B-METABOND מהר! מערכת מלט - צמנט שיניים	חומר	Parkell	S380
נקודה חדה טונגסטן המחט בעל	כלי	Roboz מכשירי ניתוח	RS-6064 ו-RS-6061	כדי להפוך את הקרס להרים את דורה
קרביד Bur HP 1/4	כלי	הנרי שיין	9990013
פרפין (גרגרי)	חומר	פישר סיינטיפיק	P31-500
שמן מינרלי, אור (NF / FCC)	חומר	פישר סיינטיפיק	O121-1
GC אלקטרוניקה 10-114 2 חלקים דבק אפוקסי	חומר	ניוארק	00Z416
1 סוג LITZ 21 AWG 40/36 אדומה אחת פוליאוריתן, ניילון (MW80-C) .041 "+ / -0.002" OD	חומר	ניו אינגלנד Wire Technologies Corporation	N28-36E-400-2	כדי להפוך את הכבל בין headstage ו מגבר
32 ערוצים הגדול מאוד שילוב headstage קנה מידה, 20x רווח	ציוד	Plexon	HST/32V-G20	Headstage