Крупномасштабные Запись нейронов Зонды Движимое кремния в Поведение грызунов

Резюме

Мы опишем методы для крупномасштабного запись нескольких отдельных единиц и местного потенциала поля в себя грызунов кремниевых зондов. Drive производства, зонд вложений на диск и процесс имплантации датчика показаны на достаточно подробно для легкого тиражирования.

Аннотация

Одна из основных задач в области неврологии связывает поведение в коллективной деятельности нейронных сборки. Понимание ввода-вывода отношений нейронов и схемы требует методы пространственной избирательности и временное разрешение подходит для механистического анализа нейронных ансамблей в себя животных, то есть запись представительно больших образцов изолированных отдельных нейронов. Ансамбль мониторинг активности нейронов шло замечательно в последнее десятилетие в больших и малых мозгом животных, включая человека в качестве субъекта ^1-11. Несколько месте записи с устройств на основе кремния особенно эффективны, потому что их масштабируемость, малый объем и геометрические конструкции.

Здесь мы опишем методы для записи нескольких отдельных нейронов и местный потенциал поля в себя грызунов, используя коммерчески доступные микро-обработанной зондов кремния с заказной компонент аксессуаров. Есть два основных варианта Fили взаимодействия кремниевых зондов для предусилителей: печатных плат и гибких кабелей. Зонд компаний-поставщиков ( http://www.neuronexustech.com/ ; http://www.sbmicrosystems.com/ ; http://www.acreo.se/ ) обычно предоставляют услуги связи и доставить зонды связаны с печатных плат или гибкие кабели. Здесь мы описываем имплантации 4-хвостовик, 32-сайт зонда прикреплены к гибкой полиимида кабель и установлены на подвижных Microdrive. Каждый шаг зонда подготовки, Microdrive, строительство и операции проиллюстрирован таким образом, что конечный пользователь может легко повторить этот процесс.

протокол

1. Строительство Microdrive

Все диски изготавливаются из тех же основных элементов: подвижная часть, которая несет в себе электрод и фиксированная часть, которая крепится к черепу. Идеальный Microdrive позволяет гладко, но достаточно долго, путешествия электрода в несколько небольших шагов, достаточно прочен, чтобы предотвратить случайное движение электрода, легко манипулировать со стороны экспериментатора, не вмешиваясь в поведение животного, небольшие размеры и легкий вес. В результате этих противоречивых требований различных набор дисков различных приложений.

Только 4 части, необходимые для создания нашего основного диска: медь плоскую головку винта, соответствующие гайки, пластиковые моста получают из одного штырьками строки и два пользовательских огранки пластин латуни.

1. Перерыв 3-контактный кусок из заголовка
2. Аккуратно вытащите центральный контакт.
3. Увеличить отверстия путем бурения через него с размером сверла № 55.
4. Вырезать-йчитать с помощью крана 00-90.
5. Вырежьте две части из латуни пластины.
6. Файл края пластины с Dremmel.
7. Просверлите отверстие в середине, как части, используя размер сверло # 65.
8. Установите диск куски так, что медные листы касаются контактов. Для этого вставьте медный винт через последовательно латунные пластины, резьбовое отверстие штырьками, вторая пластинка меди и гайки. Затяните винт мягко так, что сборка становится стабильной.
9. Припой вывода концов медные листы.
10. Файл выступающий конец винта.
11. Припой гайку с винтом. Будьте осторожны, не припой гайки латунные пластины.
12. Проверьте движение диска: повернуть винт по часовой стрелке, чтобы поднять пластиковую моста.

2. Подготовка зонда кремния

Перед установкой датчика на диск, добавить дополнительную изоляцию в области связи зонда для предотвращения cerebrospinal жидкости (ликвора) или влажности от производства коротких замыканий:

1. Взвешивание и смешивание компонентов Sylgard эластомера в соотношении 10:1.
2. Использование заостренным аппликатором хлопка, применяются Sylgard в верхней части зонда.
3. Дайте ему высохнуть в духовку нагревают при температуре 60 ° С в течение 2 часов.

Чтобы гарантировать, что записи сайтов лишены любого мусора, зонд советы должны быть очищены:

4. Подготовьте 4% разбавления Contrad моющего средства.
5. Пусть зонд замочить в моющих средств на 63 ° C в течение 2 часов.
6. Промойте чистящее средство путем погружения зонда неоднократно в дистиллированной воде.

Перед установкой датчика на диске, сопротивление каждой записи сайта должны быть проверены:

7. Опустите зонд в 0,9% раствор, и подключить его к импеданс-метра. Если слишком много сайтов записи имеют неправильное сопротивление, повторите шаги 2.4-2.6 или рассмотреть возможность использования различных зонда.Здесь мы используем сопротивление модуля кондиционирования с Фредериком Haer, Co (ФЭК) в сочетании с домашним селектора каналов. Кроме того, по niPOD NeuroNexus, Inc или NanoZ по Neuralynx, Inc позволяет контролировать сопротивление всех зонд каналов одновременно.

3. Нанесение зонда Microdrive

1. С помощью лезвия, нарезать канавки в нескольких мостов для создания прочной поверхности.
2. Сопоставлять зонд к мосту привода. Эта процедура лучше всего делать под операционным микроскопом, держа диск с зажимом и настройки датчика по микроманипулятор чтобы черенки отлично параллельно с диска винта. Это гарантирует, что во время продвижения по службе, движение зонда черенками в ткани головного мозга без «резки» через него. Точная глубина зонд советы относительно базового привода должна быть определена на данном этапе, принимая во внимание глубину целевой структуры с поверхностичереп.
3. Зонд затем крепится к мосту с зажимом цемента.
4. Дополнительно: для визуализации зонда след в мозгу, DiI раствор (1-2% растворяется в этаноле) могут быть применены к задней части датчика на данном этапе.

4. Подготовка черепа

До операции, ссылка и наземных электродов и частей на голове клетки Фарадея готовы:

1. Отрежьте два 2 "длинные куски медной проволоки, и припаять один конец каждой изолированной медной проволоки около 1 мм.
2. С помощью иглы, очистить голову от 00-90, 1/8 "винтом из нержавеющей стали и припаять один кусок медного провода к нему. Пайка таких нержавеющая сталь винт заземления, электроды требует соответствующего потока (например, N-3 Универсальный Поток из Ла-Co) и высокой температуры пайки чаевые. Тщательно предотвращения припой из впадающих в паз винта. Это будет использоваться как основание электрода. Повторите с другой винт и медной проволоки, чтобы подготовитьэлектрода сравнения.
3. Вырезать trapeziodal отрывки из медной сетки. Эти части будут собраны для защиты headstage.

Хирургические инструменты и подготовки такие же, как используется во многих небольших операций животным. Вся операция проводится под наркозом глубоко ИФ с использованием асептических условиях, в соответствии с НИЗ утвержденных принципов. Пожалуйста, обратите внимание, что (макет), операции показаны в этом видео только для демонстрационных целей. Для соответствующих целей и видимость съемки, несколько подготовительных шагов, хирургические меры предосторожности и послеоперационные процедуры не показаны / видимыми или обсуждается.

До операции, все компоненты и материалы должны быть стерилизованы, после соответствующих процедур (см. Руководство по выживанию хирургии грызунов; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf). Во время операции, стерильные поля на череп подготовлены и выделены стерильной драпировки. В конце операции, антибиотики широкого спектраpplied локально, так и длительного действия боль убийца внутримышечно (например, бупренорфин, [Buprenex] 0,05 мг / кг). Кроме того, обезболивающее (например, ибупрофен) содержится в питьевой воде около 60 часов mg/kg/24 течение 5 дней. Для правильной хирургической анестезии и процедуры, проконсультироваться с соответствующими источниками ^12.

4. Установить животных в стереотаксического аппарата, бриться и чистить кожу головы ^13.
5. Разрежьте кожу вдоль средней линии и отодвинуть кожу головы. Удаление надкостницы, чистой и сухой череп.
6. Измерьте местоположение и расстояние между брегмы и лямбда, и определить координаты х и у участка имплантации датчика соответственно помощью стереотаксической атлас ^14. Отметьте место, очищая крест на черепе с помощью скальпеля.
7. Просверлите черепа с помощью круглой сверло головы (размером ¼) и винты диска поддержки (из нержавеющей стали, 000-120, 1/16 ") на полпути в кости, на разных пластинах кости на вершинея на стороне черепа. Винты обеспечит якорей безопасно связь головной убор к черепу.
8. Просверлите отверстия над мозжечком и вставить землю и электродов, подготовленный в шаге 4.2. Для регистрации локальных потенциалов поля (LFP), выбор сайта ссылка имеет решающее значение. Этот сайт выбрана потому, что мозжечковая LFP является самым маленьким из всех областях коры и мышечных артефактов минимально возможным на этом месте средней линии.
9. Применение дентина активатора (Metabond комплект) с помощью крошечной кистью по всей поверхности черепа. Промойте его с 0,9% раствором.
10. Применение стоматологического цемента (Metabond комплект, следуйте инструкциям производителя для смешивания) на черепе, тщательно покрытие анкерные болты и землю и электродов, но оставляя места имплантации датчика ясно.
11. Закрепите четыре медные сетки закрылки (подготовлен в шаге 4.3) к черепу. Для этого цемента узкая база каждого из них на передней, левой, правой и задней сторонах черепа. Thэлектронной медь никогда не должны находиться в прямом контакте с костью, но всегда, разделенных слоем цемента.

5. Подготовка поверхности мозга

1. С помощью круглого сверла голову, сверлить вокруг места имплантации в несколько этапов, в то время часто орошения кости с физиологическим раствором.
2. Осторожно снимите костный лоскут и орошать поверхность мозга.
3. Для установки нескольких голени зонд, большая полоса оболочки удаляется. Два инструмента, необходимого для удаления оболочки: скальпель и крюк получают из насекомых иглы (в качестве альтернативы стандартным микроэлектрода вольфрама). Согните кончике иглы, нажав на твердую поверхность (например, предметное стекло стекло), и приложите его к ручке (здесь, кусок деревянного Q-Tip, наоборот microdissecting иглодержатель).
4. Снимите оболочку с крюка, и резать скальпелем. Особое внимание уделяется, чтобы избежать повреждения мягкой, сосудов и поверхности коры головного мозга. Малые кровотечения могут быть решенысоленой орошения. Если кровотечение происходит или коры головного мозга находится под угрозой в любом случае, следует учитывать прекращение операции и подготовку другого животного.

6. Имплантация зонда

На данном этапе, плотность и ориентация коры надводных кораблей тщательно оценены. Стереотаксических координат должны быть скорректированы, так как зонд должен проникнуть в мозг, в зону, свободную от более крупных судов.

Для имплантации, привод сборки могут быть проведены с крокодил прикреплены к стереотаксической владельца. Бесперебойное видимости поверхности мозга и советы зонда имеют решающее значение для успешного проникновения.

1. Медленно опустите зонд до примерно 1 мм выше намеченной цели, постоянно орошения трепанация черепа с физиологическим раствором. Для записи неокортекса, зонд советы опускается в коре примерно 0,5 мм и подняли обратно на поверхности.
2. Печать трепанация черепа, применяя теплую расплавленную смесь масла воска и парафина с помощью иглы (10-20г воска в 10 мл парафинового масла, нагревают до 65 ° C). Перед нанесением охладить смесь до 30 ° C и проверить плотность. Он должен быть достаточно мягким, чтобы облегчить движение зонда). Для облегчения полного охвата, смесь может быть расплавлен на месте, приближаясь к закаленные воск кончиком микро-cauterizer.
3. Прикрепите нижнюю часть диска черепа с рукояткой цемент, будьте осторожны, чтобы оставить гайка свободно вращаться. Это крайне важно, чтобы избежать случайного "поднять" привода на данном этапе, в противном случае датчик может привести к повреждению мозга. После того, как диск крепится к черепу, плавное движение зонда должна быть проверена.
4. Цемент разъем части зонда к черепу.

7. Создание на голове клетки Фарадея

1. Потяните вверх и собрать закрылки медной сетки в защитный цилиндр вокруг зонда и DRIве. Цилиндра и служит электрический щит от внешних шумов и артефактов, медленно волны, создаваемой заряженными усы в себя животных.
2. Отрегулируйте высоту цилиндра срезая излишки материала, поэтому медные сетки на одном уровне с верхней части датчика разъем.
3. Припаяйте провода от ведения и землю винты в соответствующие контакты разъема. Кроме пайка соседних закрылки сетки меди вместе, чтобы обеспечить их непрерывность электрической цепи, и припаять провод заземления к медной сетки.
4. Нанесите слой сцепления цемента на медной сетки укрепить его и не допустить прямого контакта между металлом и кожей животного. По желанию, нанесите слой эпоксидной смолы для дальнейшего укрепления головные уборы.
5. Проверьте движение ходовой винт.
6. Крышка в верхней части головного убора с частью вырезанные из резиновых перчаток.

8. Запись в свободно движущихся животных

1. После того, как соотели послеоперационного ухода, подключить животных к записи системы с использованием высоких headstage сопротивление и легкие, ультрапластичным многожильного кабеля. Противовес весом головные уборы.
2. Проверьте качество записи каждый день в homecage. Положение записи сайтов судят как единица стрельбы узоры и формы местного потенциала области. Опустите зонд постепенно, поворачивая винт небольшими порциями (обычно 1/8 до 1/4 оборота в день, т.е. 35-70 мкм) до целевой структуры будет достигнуто.

9. Представитель Результаты

Электрофизиологические сигналов (локальный потенциал поля и блок деятельности) зависит от структуры и записано текущее поведение животного. На рисунке 1 показаны примеры 32-канальный СА1 гиппокампа записи в то время как крыса изучает открытое поле. Обратите внимание на выдающийся 8 Гц (тета-диапазоне) колебаний локальный потенциал поля при исследовании с вирerimposed пики на несколько черенков и объектов (примеры шипами указывают стрелки). Для анализа активности нейронов устройство, шипы обнаружены и сортируются в единичных экземплярах с использованием кластерного анализа их сигналов ^15-16.

Рисунок 1. СА1 гиппокампа записей в себя крыс с помощью 4 х 8 черенки сайтов кремния зонда. Аудиозаписи широкополосных и дискретизации 20 000 Гц, что позволяет изучать как локальное поле потенциальных колебаний (например, "тета" группа 8 Гц ритм) и пики активности нейронов.

Таблица 1. Альтернативы реактивов и оборудования.

Обсуждение

Этот фильм иллюстрирует имплантации кремния зонды для хронических крупномасштабных записей в себя крысой. Критические шаги по обеспечению качества записи активности нейронов возникают хрупкость и биологические (мозговой ткани) и технические (кремний зонд) материалов. Особое внимани...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Тип	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Кремний зонд Buzsaki32, 4 х 8 черенки сайтов. Упаковка: гибкий кабель полиамида	Материал	NeuroNexus	Датчик: buzsaki32 Упаковка: HC32	Запись зонд
Круглый винт латунь, 00-90 х 1/2 круглого Винты латунные	Материал	JIMorris	R0090B500	Диск часть
Латунь Hex Nut, 00-90	Материал	JIMorris	N0090B	Диск часть
Латунная C260 Газа, ASTM-B36 Толщина: 0.025 ", длина: 12", Ширина: 1/2 "	Материал	Мелкие детали	B000FMYU72	Диск часть
Разъем заголовок, шаг 2 мм, мпиво, однорядные, straigt, 36 позиций	Материал	Конденсаторы	2163S-36-ND	Диск часть
2-х частей Sylgard кремния эластомера	Материал	Инструменты Всемирной Precision	SYLG184	Для дополнительной изоляции-зонда
Decon Contrad 70 жидких моющих средств	Реагент	Fisher Scientific	04-355 Decon лаборатории №: 1002	Для очистки записи сайтов
Сопротивление Модуль кондиционирования	Оборудование	FHC Инк	55-70-0	Сопротивление метр
niPOD - 32 каналов	Оборудование	Neuronexus	niPOD -32	Сопротивление метр
Сцепление цементного промышленного класса	Материал	Заткните Dentsply	675571 (порошок) 675 572 (растворитель)	Ручка сеМент
1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлорат ('DiI; DiIC18 (3))	Реагент	Invitrogen	D282	Чтобы пятно зонда трек в мозг
Нержавеющая сталь крепежный винт, Binding руководитель шлицевая Drive, # 00-90, 1/8 "	Материал	Мелкие детали	MX-0090-02B	Наземные и ссылки винты
Магнит проволоки, 20G, нейлон-полиуретановым покрытием, MW80	Материал	Мелкие детали	B000IJYRP2	Наземные и ссылки проволоки
Нержавеющая сталь крепежный винт, Binding глава шлицевая Drive, # 000-120, 1/16 "	Материал	Мелкие детали	MX-000120-01B	Анкерные болты
N-3 Все жидкие целью Flux	Реагент	La-Co (MARKAL)	23512	Позволяет припоя из нержавеющей стали
Microgrid Precision Расширенный медные	Материал	Dexmet	3 Cu6 FA-050	Медная сетка для на голове клетки Фарадея
C & B-METABOND Быстро! Цемент системы - дентин Activator	Материал	Parkell	S380
C & B-METABOND Быстро! Цемент системы - зубным цементом	Материал	Parkell	S380
Острые иглы вольфрама точки и держатель	Инструмент	Roboz Хирургические инструменты	RS-6064 и RS-6061	Для того чтобы сделать крюк, чтобы снять оболочку
Карбид бора HP 1/4	Инструмент	Генри Шайн	9990013
Парафин (гранулы)	Материал	Fisher Scientific	P31-500
Минеральное масло, Light (NF / FCC)	Материал	Fisher Scientific	O121-1
GC ЭЛЕКТРОНИКА 10-114 2-Part эпоксидный клей	Материал	Ньюарк	00Z416
Тип 1 литцендрат 21 AWG 40/36 Красная Одноместный полиуретановым нейлон (MW80-C) к 0,041 "+ / -0,002" OD	Материал	Новая Англия провода Technologies Corporation	N28-36E-400-2	Для того, чтобы кабель между headstage и усилитель
32-канальный Очень Большой headstage степенью интеграции, 20x усиление	Оборудование	Plexon	HST/32V-G20	Headstage