Kemirgenler davranmak yılında Hareketli Silikon Problar tarafından Nöronlar Büyük ölçekli Kaydı

Özet

Biz büyük ölçekli birden çok tek birimlerinin kayıt ve silikon sondalar ile kemirgenlerde davranan yerel alanda potansiyel yöntemleri açıklanmaktadır. Sürücü imalat, sürücü ve prob implantasyon süreçleri prob eki kolay çoğaltma için yeterli ayrıntıları gösterilmiştir.

Özet

Nörobilimdeki büyük bir zorluk nöral meclislerinin kolektif etkinlik davranış bağlantı olduğunu. Nöron ve devrelerin girdi-çıktı ilişkileri anlama mekansal seçicilik ve davranışlar hayvan nöral topluluklar, izole tek nöronların temsili büyük örnekleri yani kayıt mekanistik analizi için uygun zamansal çözünürlüğe sahip yöntemleri gerektirir. Nöronal aktivitenin Ensemble izleme insan denekler ^1-11 dahil olmak üzere küçük ve büyük beyinli hem hayvanlar, geçtiğimiz on yılda oldukça ilerlemiştir. Silikon tabanlı cihazlar ile çoklu-site kayıt dolayı ölçeklenebilirlik, küçük hacimli ve geometrik tasarım özellikle etkilidir.

Burada, birden çok tek nöronlar ve ısmarlama aksesuar parçaları ile piyasada bulunan mikro-işlenmiş silikon problar kullanılarak, kemirgenler davrandığını yerel alanda potansiyel kaydedilmesi için yöntemler açıklanmaktadır. İki temel seçenek f vardırya preamplifikatörler silikon sondalar arayüz: baskılı devre kartlarına ve esnek kablolar. Prob temin şirketlerin ( http://www.neuronexustech.com/ ; http://www.sbmicrosystems.com/ ; http://www.acreo.se/ ) genellikle bağ hizmet sunmak ve baskılı devre kartlarına bağlanmış probları teslim veya esnek kabloları. Burada, esnek poliimid kablo bağlı bir 4-şaftı, 32 yerinde prob implantasyon tarif eder, ve bir hareket ettirilebilir microdrive üzerine monte edilmiştir. Prob hazırlanması her adım, microdrive yapı ve cerrahi son kullanıcı kolaylıkla işlem çoğaltmak böylece gösterilmiştir.

Protokol

1. Microdrive İnşaatı

Elektrot ve kafatası tutturulduğu sabit bir parçası taşıyan hareketli bir parçası: Tüm sürücüler aynı temel elementlerden yapılır. İdeal Microdrive, çok sayıda küçük adımlarla elektrodun düzgün ama yeterince uzun seyahat etmeyi sağlar hayvanın boyutu küçük davranış ve hafifliği ile müdahale etmeden deneyci tarafından manipüle kolay elektrot yanlışlıkla hareketi önlemek için yeterince sağlam. Bu rakip gereksinimleri bir sonucu olarak, farklı bir sürücü paketi farklı uygulamalar.

Bir pirinç düz kafalı vida, eşleşen bir somun, bir tek satır pin başlık ve iki özel kesim pirinç plakalardan hazırlanan bir plastik köprü: Sadece 4 parça temel sürücü oluşturmak için gereklidir.

1. Başlığından 3 pinli bir parça Break
2. Yavaşça orta pin çekin.
3. Bir matkap boyutu # 55 ile ile delerek delik büyüt.
4. Bir inci Kes00-90 musluk kullanarak okuyun.
5. Pirinç levha dışında iki parça kesin.
6. Bir Dremmel ile plakaların kenarları hazırlamaktadır.
7. Bir matkap boyutu # 65 kullanarak iki parçanın ortasında bir delik delin.
8. Pirinç plakalar pimlere dokunmaktan, böylece sürücü parçaları birleştirin. Bunu başarmak için, art arda aracılığıyla pirinç levha, vidalı pimi başlık delik, ikinci pirinç levha ve somun pirinç vida takın. Yavaşça montaj stabil hale gelmesi vidayı sıkın.
9. Lehim pin pirinç levhalara biter.
10. Vida çıkıntılı sonuna Dosya.
11. Vida üzerine lehimleyin somun. Dikkatli olun değil lehim pirinç levha için fındık.
12. Sürücünün hareket test edin: plastik köprü yükseltmek için saat yönünde vidasını.

2. Silikon prob hazırlanması

Sürücüye prob sabitleme önce, cerebr önlemek için prob bağ alanı için ekstra yalıtım ekleyinospinal sıvısı (BOS) veya kısa devreler üretmekten nem:

1. Tartılır ve 10:1 oranında Sylgard Elastomer karıştırınız.
2. Sivriltilmiş bir pamuk aplikatör kullanarak, prob üst ucuna Sylgard geçerlidir.
3. 2 saat boyunca 60 ° C'de ısıtılmış bir fırın içinde kuru edelim.

Kayıt sitelerin herhangi bir enkaz yoksun olduğundan emin olmak için, prob uçları temizlenmesi gerekir:

4. Contrad deterjan% 4 seyreltme hazırlayın.
5. Prob, en azından 2 saat boyunca 63 ° C'de deterjan emmek sağlar.
6. Distile su ile tekrar tekrar probu batırarak deterjan durulayın.

Sürücüye prob sabitleme önce, her kayıt sitenin empedansı kontrol edilmelidir:

7. % 0.9 serum fizyolojik içinde prob daldırın ve bir empedans metre bağlayın. Çok kaydına yanlış empedansı adımları tekrar 2,4-2,6 varsa veya farklı bir prob kullanarak düşünün.Burada el yapımı bir kanal seçici ile birlikte Frederick Haer, Co (FHC), bir Empedans İklimlendirme Modülü. Alternatif olarak, Neuralynx, Inc NeuroNexus, Inc veya NanoZ bir niPOD eşzamanlı olarak her prob kanalların empedansının izleme sağlar.

3. Microdrive için prob İliştirilmesi

1. Bir jilet kullanarak, engebeli bir yüzey oluşturmak için köprü birden çok oluklar kesti.
2. Sürücünün köprüye prob Appose. Bu prosedür iyi bir kelepçe ile sürücü tutarak ve Shanks sürücü vida ile mükemmel paralel olacak şekilde bir micromanipulator tarafından prob ayarlayarak, bir işletim mikroskop altında yapılır. Bu gelişme sırasında, olmayan beyin dokusu içine probu Shanks hareket baştan sona 'kesme' olmasını sağlar. Sürücünün tabanına göre prob uçları arasında tam derinliği yüzeyinden dikkate hedef yapısı derinliği alarak, bu aşamada tespit edilmelidirkafatası.
3. Prob daha sonra tutuş çimento ile köprü sabitlenir.
4. İsteğe bağlı: beyin prob parça görselleme için, DII solüsyonu (etanol içinde seyreltilmiş% 1-2) Bu aşamada, probun geri uygulanabilir.

4. Kafatası hazırlanması

Ameliyat öncesi, referans elektrotlar ve öğütülmüş, ve on-kafası Faraday kafesinin parça hazırlanır:

1. Bakır tel iki 2 "-uzun parçalar ve yaklaşık 1 mm için her yalıtılmış bakır tel lehim bir ucunu kesin.
2. Bir iğne kullanarak, bakır tel 00-90, 1/8 "paslanmaz çelik vida ve lehim tek parça başı kazıyın. Lehimleme gibi paslanmaz çelik zemin vida elektrotlar uygun bir akı (örneğin, N-3 Her amaca gerektirir La-Co'dan akı) ve yüksek sıcaklıklarda lehimleme ucu. dikkatlice vida oluk akan herhangi bir lehim engeller. Bu toprak elektrot olarak kullanılır. hazırlamak için başka bir vida ve bakır tel ile tekrarlayınreferans elektrot.
3. Bakır mesh gelen trapeziodal parçalar kesin. Bu parçalar headstage korumak üzere monte edilir.

Cerrahi aletler ve hazırlama çok sayıda küçük hayvan cerrahisinde kullanılan aynıdır. Tüm cerrahi NIH onaylı yönergelere göre, aseptik koşullarda kullanarak, derin izofluran anestezisi altında yapılır. Bu video gösterilir (alay) cerrahi gösteri amaçlıdır unutmayın. Uygun görüş ve filme amaçları, birkaç hazırlık adımları, cerrahi ve postoperatif önlemleri prosedürleri için gösterilen görünür / veya tartışılmamıştır.

Ameliyattan önce tüm bileşenleri ve malzemeleri uygun prosedürler (; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf Survival Kemirgen Cerrahisi Yönergeleri) takiben, sterilize edilmelidir. Ameliyat sırasında, kafatası üzerinde steril bir alan steril örtü tarafından hazırlanmış ve izole edilir. Sonunda cerrahi, geniş spektrumlu bir antibiyotiklokal pplied ve bir uzun-etkili ağrı kesici (örn., buprenorfin, [Buprenex] 0,05 mg / kg) intramüsküler verilir. Buna ek olarak, ağrı kesici (örn., ibuprofen) 5 gün süre yaklaşık 60 saat mg/kg/24 azından içme suyu temin edilir. Uygun cerrahi ve anestezi prosedürleri için, uygun kaynakları ¹² danışın.

4. Stereotaksik aparatı hayvan yükleyin, tıraş ve saç derisi ¹³ temizleyin.
5. Orta hat boyunca deri kesin ve kafa derisi kenara itin. , Periost çıkarın temizleyin ve kafatası kurulayın.
6. Bregma ve lambda arasındaki mesafeyi ölçün ve buna göre bir stereotaksik atlas ¹⁴ ile sonda implantasyon sitenin x ve y koordinatlarını belirlemek. Bir neşter ile kafatası üzerinde bir haç kazınarak sitesi işaretleyin.
7. Üst bir farklı kemik plakalar üzerinde, yarım kemik içine bir yuvarlak başlı matkap (boyut ¼) ve sürücü destek vidalarını (paslanmaz çelik, 000-120, 1/16 ") kullanarak kafatası MatkapKafatasının tarafında nd. Vidaları güvenli bir bağ başlıklar için kafatasına çapa sağlayacaktır.
8. Beyincik üzerinde delik açın ve yere ve adım 4.2 hazırlanmış referans elektrotlar yerleştirin. Yerel alan potansiyeller (LFP) kayıt için referans site seçimi önemlidir. Serebellar LFP bu orta hat yerde minimal tüm kortikal bölgelerinde ve kas eserler içinde en küçüğü olduğu için bu site seçilir.
9. Kafatasının tüm yüzey üzerinde küçük bir fırça kullanarak dentin aktivatörü (Metabond kiti) uygulayın. % 0.9 tuzlu su ile durulayın.
10. Diş çimento Uygula (Metabond kiti; karıştırma için üreticinin talimatlarına) dikkatlice demir vida ve zemin ve referans elektrotlar kapsayan, ama sonda implantasyon sitesi açık bırakarak, kafatası üzerinde.
11. Dört bakır mesh flep (adım 4.3 hazırlanmış) kafatasına sabitleyin. Bunun için, kafatasının ön, sağ, sol ve arka taraf için bunların her birinin dar tabanı çimento. The bakır kemik ile doğrudan temas halinde olabilir ama her zaman çimento bir katmanı ayrılmış asla.

5.. Beynin yüzey hazırlama

1. Sık sık serum fizyolojik ile kemik sulama sırasında bir yuvarlak başlı matkap ucu kullanarak, birden fazla aşamada implantasyon site çevresinde delin.
2. Dikkatle kemik flep kaldırmak ve beyin yüzeyi sulanması.
3. Bir çok-şaft prob yerleştirilmesi için, dura büyük bir şerit kaldırılır. Bir neşter ve bir böcek iğnesi (alternatif olarak, standart bir tungsten mikroelektrot) hazırlanan bir kanca: İki araç dura kaldırmak için gereklidir. Sert bir yüzeye (örneğin cam mikroskop lamı) karşı iterek iğne ucu bükün ve (burada, tahta Q-tip bir parça; alternatif bir microdissecting iğne tutucu) bir kulpa takınız.
4. Kanca ile dura kaldırın ve bir neşter ile kesmek. Özel bakım pia, gemi ve neokorteks yüzeyine zarar vermemek için alınır. Küçük kanama çözülebilirtuzlu sulama ile. Majör kanama meydana geldiğinde veya neokorteks herhangi bir şekilde tehlikeye atılırsa, bir ameliyat sonlandırma ve başka bir hayvan hazırlamak düşünmelisiniz.

6. Prob yerleştirilmesi

Bu aşamada, kortikal yüzey damarlarının yoğunluğu ve yönü dikkatle değerlendirilmektedir. Prob büyük gemilerin serbest bir alanda beyin nüfuz çünkü Stereotaksik koordinatları, ayarlanmalıdır.

Implantasyon için, sürücü montaj stereotaksik sahibine bağlı bir timsah klibi ile tutulabilir. Kesintisiz beyin yüzeyinin görüş ve prob uçları başarılı penetrasyon için önemlidir.

1. Sürekli serum fizyolojik ile kraniotomi sulama yavas, amaçlanan hedefin üzerinde yaklaşık 1 mm prob aşağı düşürmek. Neokortikal kayıt için, prob uçları korteksin yaklaşık 0,5 mm içine indirilir ve yüzeye yakın geri kaldırdı.
2. Bir iğne (10 mL parafin yağı mumu 10-20g, 65 ° C'de ısıtıldı) vasıtasıyla balmumu ve parafin yağı sıcak erimiş karışımın uygulanması ile kraniotomi mühürlemek. Uygulamadan önce, 30 ° C karışımı serin ve yoğunluğu test edin. It) kolay prob hareketi sağlayacak kadar yumuşak olmalıdır. Tam kapsama kolaylaştırmak için, karışım, bir mikro-cauterizer ucu ile sertleştirilmiş balmumu yaklaşarak in situ eritilerek verilebilir.
3. Açmak için fındık serbest bırakmak için dikkatli olmak, kavrama çimento ile kafatasına sürücünün alt takın. Bu aşamada, sürücünün herhangi bir kaza "bump" önlemek için son derece önemlidir, aksi takdirde prob korteks zarar verecektir. Sürücü kafatasına sabitlenir sonra prob düzgün hareket doğrulanması gerekir.
4. Kafatasına prob bağlantı parçası Çimento.

7. Üzerinde kafa Faraday kafesi Bina

1. Prob ve dri çevresinde koruyucu bir silindirin içine bakır mesh kapakları yukarı çekin ve montajıettik. Silindir ayrıca çevresel gürültü ve davranışlar hayvan tahsil bıyıkları tarafından üretilen yavaş dalga eserler karşı bir elektrik kalkan görevi görür.
2. Bakır mesh prob konektörünün üst düzey yüzden fazla malzeme uzak keserek silindir yüksekliğini ayarlayın.
3. Lehim referans ve toprak vidası gelen konektörün uygun pinlerine teller. Ayrıca lehim bitişik bakır mesh flep birlikte bakır mesh için topraklama kablosu, elektriksel sürekliliği sağlamak ve lehim.
4. Bu durumu güçlendirir ve metal ve hayvanın deri arasında herhangi bir doğrudan temas önlemek için bakır mesh kavrama çimento tabakası uygulayın. İsteğe bağlı olarak, daha fazla başlık pekiştirmek için epoksi reçine tabakası uygulayın.
5. Sürücü vida hareketi test.
6. Bir lastik eldiven bir parça kesme ile headgear üst örtün.

8. Serbestçe hareket eden hayvan kayıt

1. Appropri sonraameliyat sonrası bakım yedik, yüksek empedanslı bir headstage ve hafif, ultraflexible çok telli kablo kullanarak kayıt sistemine hayvan bağlamak. Denkleştirme başlık ağırlığı.
2. Homecage her gün kayıt kalitesini test edin. Kayıt sitelerin konumu birimi ateş desenleri ve yerel alan potansiyelleri şeklinde iki tarafından değerlendirilecektir. Hedef yapısı ulaşılana kadar küçük artışlarla (genellikle 1/8 günde 1/4 tur, yani 35-70 mikrometre) vidasını yavaş yavaş prob indirin.

9. Temsilcisi Sonuçlar

Elektrofizyolojik sinyaller (yerel alan potansiyel ve birim faaliyet) kaydedilen yapısı ve hayvan geçerli davranış bağlı olarak değişir. Sıçan açık bir alanda keşfe iken Şekil 1 32 kanallı CA1 hipokampal kayıtların örneklerini gösterir. Sup keşif sırasında yerel alanın potansiyelinin önemli 8 Hz (teta bant) salınım Notbirden Shanks ve siteler (ok ile gösterilen başak örnekler) üzerinde spiking erimposed. Nöronal birim faaliyet analiz etmek, ani dalga biçimlerinin ^15-16 küme analizi kullanılarak tek birimler halinde algılanır ve sıralanır.

Şekil 1. 4 saplar x 8 siteleri silikon prob kullanarak davranmaya sıçan CA1 Hipokampal kayıtları. Kayıtlar geniş bant ve yerel alanda potansiyel dalgalanmalar (örneğin, "teta" band 8 Hz ritm) ve nöronal çivileme aktivite hem de çalışmak için izin 20 000 Hz de örneklenmiş vardır.

Tablo 1. Kullanılan reaktifler ve ekipman alternatifleri.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu film davranmaya sıçan kronik büyük ölçekli kayıtları için silikon probların implantasyon prosedürü gösterir. Nöronal aktivitenin kaliteli kayıtlar sağlamak için kritik adımlar hem biyolojik (beyin dokusu) ve teknik (silikon prob) malzemelerin kırılganlığı ortaya çıkar. Herhangi bir uzaktan "sert" yüzey (bir dura çıkarmadan beyinde bunları implant çalıştı örneğin, Shanks kıracak) ile saplar herhangi bir teması önlemek için prob işlerken özel bir dikkat gerekir. Benzer...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isim	Tip	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
Silikon prob Buzsaki32, 4 saplar x 8 siteleri. Ambalaj: esnek polyamid kablo	Malzeme	NeuroNexus	Probe: buzsaki32 Ambalaj: HC32	Kayıt prob
Yuvarlak Pirinç Vida, 00-90 x 1/2 Yuvarlak Pirinç vidalar	Malzeme	JIMorris	R0090B500	Sürücü parçası
Pirinç Hex Nut, 00-90	Malzeme	JIMorris	N0090B	Sürücü parçası
Pirinç C260 Strip, ASTM-B36 Kalınlık: 0.025 ", Süre: 12", Genişlik: 1/2 "	Malzeme	Küçük Parçalar	B000FMYU72	Sürücü parçası
Bağlayıcı Başlık, zift 2mm, male, tek satır straigt, 36 pozisyonları	Malzeme	Digikey	2163S-36-ND	Sürücü parçası
2-bileşenli Sylgard silikon elastomer	Malzeme	Dünya Hassas Aletler	SYLG184	Prob ekstra izole etmek için
Temizlenme 70 Sıvı Deterjan Contrad	Reaktif	Fisher Scientific	04-355 Temizlenme Laboratuvarları No: 1002	Kayıt siteleri temizlemek için
Empedans İklimlendirme Modülü	Ekipman	FHC A.Ş.	55-70-0	Empedans metre
niPOD - 32 kanal	Ekipman	Neuronexus	niPOD -32	Empedans metre
Kavrama Çimento Sanayi Sınıf	Malzeme	Caulk Dentsply	675.571 (toz) 675.572 (solvent)	Kavrama ceMent
1,1 '-dioktadesil-3, 3,3', perklorat (; DiIC18 (3) 'DII') 3'-tetramethylindocarbocyanine	Reaktif	Invitrogen	D282	Beyinde prob parça leke
Paslanmaz Çelik Makine Vida, bağlama Başkanı, Oluklu Drive, # 00-90, 1/8 "	Malzeme	Küçük Parçalar	MX-0090-02B	Zemin ve referans vidalar
Mıknatıs tel, 20G, naylon-poliüretan kaplama, MW80	Malzeme	Küçük Parçalar	B000IJYRP2	Zemin ve referans tel
Paslanmaz Çelik Makine Vida, Sürücü Yarıklı Cilt Başkanı, # 000-120, 1/16 "	Malzeme	Küçük Parçalar	MX-000.120-01B	Çapa vidalar
N-3 Her amaca Akı Sıvı	Reaktif	La-Co (Markal)	23512	Lehim paslanmaz çelik sağlar
MicroGrid Hassas Bakır Genişletilmiş	Malzeme	Dexmet	3 CU6-050 FA	Üzerine kafa Faraday kafesi için bakır örgü
C & B Metabond Hızlı! Çimento Sistemi - Dentin Activator	Malzeme	Parkell	S380
C & B Metabond Hızlı! Çimento Sistemi - Diş çimento	Malzeme	Parkell	S380
Sharp noktası tungsten iğne ve tutucu	Araç	Roboz Cerrahi aletler	RS-6064 ve RS-6061	Kanca dura kaldırmak için yapmak için
Karbür Bur HP 1/4	Araç	Henry Schein	9990013
Parafin (Granül)	Malzeme	Fisher Scientific	P31-500
Madeni Yağ, Işık (NF / FCC)	Malzeme	Fisher Scientific	O121-1
GC ELECTRONICS 10-114 2-Bölüm Epoksi Yapıştırıcı	Malzeme	Newark	00Z416
Tip 1 LITZ 21 AWG 40/36 Kırmızı 0.041 TO (MW80-C) Poliüretan-Naylon Tek "+ / -0.002" OD	Malzeme	New England Tel Technologies Corporation	N28-36E-400-2	Headstage ve amplifikatör arasındaki kablo yapmak için
32-kanal Çok Büyük Ölçekli Entegrasyon headstage, 20x kazanç	Ekipman	Plexon	HST/32V-G20	Headstage