À grande échelle d'enregistrement des neurones par des sondes de silicium mobiles à se comporter Rongeurs

Résumé

Nous décrivons les méthodes à grande échelle d'enregistrement de plusieurs unités simples et le potentiel de champ local à se comporter les rongeurs avec des sondes de silicium. Disque de fabrication, de fixation de sonde sur le disque et les processus d'implantation de la sonde sont illustrés dans des détails suffisants pour faciliter la reproduction.

Résumé

Un défi majeur en neurosciences est lien entre le comportement à l'activité collective des assemblées de neurones. Compréhension des relations d'entrée-sortie de neurones et les circuits nécessite des méthodes avec la sélectivité spatiale et la résolution temporelle appropriée pour l'analyse mécaniste des ensembles de neurones chez l'animal se comporter, de l'enregistrement soit d'échantillons représentative de grandes isolés neurones isolés. Ensemble de surveillance de l'activité neuronale a progressé de manière remarquable dans la dernière décennie chez les animaux à la fois petits et grands-cerveau, y compris des sujets humains ^1-11. Multiple-site d'enregistrement avec le silicium à base de dispositifs sont particulièrement efficaces en raison de leur évolutivité, faible volume et la conception géométrique.

Ici, nous décrivons des méthodes pour enregistrer plusieurs neurones isolés et potentiels de champ local à se comporter les rongeurs, en utilisant des sondes disponibles dans le commerce de silicium micro-usinées, avec des composants accessoires faits sur mesure. Il ya deux options de base fou l'interfaçage des sondes de silicium pour préamplificateurs: cartes de circuits imprimés et les câbles flexibles. Entreprises de la sonde d'alimentation ( http://www.neuronexustech.com/ ; http://www.sbmicrosystems.com/ ; http://www.acreo.se/ ) fournissent généralement le service de liaison et de fournir des sondes liées aux cartes de circuits imprimés ou câbles flexibles. Ici, nous décrivons l'implantation d'un 4-tige, 32 place sonde attachée à souple de polyimide par câble, et monté sur un microdrive mobile. Chaque étape de la préparation de la sonde, la construction et de la chirurgie microdrive est illustrée de façon que l'utilisateur final peut facilement reproduire le processus.

Protocole

1. La construction de la microdrive

Tous les disques sont fabriqués à partir des mêmes éléments de base: une partie mobile, qui porte l'électrode et une partie fixe, qui est ancré par rapport au crâne. Un microdrive idéale permet lisse, mais à long voyage assez de l'électrode dans de multiples petites étapes, est suffisamment robuste pour prévenir tout mouvement accidentel de l'électrode, facile à manipuler par l'expérimentateur sans interférer avec le comportement de l'animal, de petite taille et de poids léger. En raison de ces exigences concurrentes, différente suite de disques différentes applications.

Seuls les 4 parties sont nécessaires pour construire notre disque de base: une vis à tête plate en laiton, un écrou correspondant, un pont en plastique préparés à partir d'un en-tête broches seule rangée et deux plaques de laiton sur mesure coupées.

1. Casser un morceau à 3 broches de l'en-tête
2. Tirez doucement sur la broche du milieu.
3. Agrandir le trou en perçant à travers elle avec une taille de foret N ° 55.
4. Coupez un elu à l'aide du robinet de 00 à 90.
5. Coupez deux morceaux de la plaque en laiton.
6. Limer les bords des plaques avec un Dremmel.
7. Percez un trou au milieu des deux morceaux en utilisant une taille de foret N ° 65.
8. Assembler les pièces d'entraînement de telle sorte que les plaques de cuivre se touchent les repères. Pour ce faire, insérez la vis en laiton à travers, successivement, la plaque de laiton, le trou tige filetée en-tête, la plaque de laiton seconde, et l'écrou. Serrer la vis doucement afin que l'ensemble devient stable.
9. Souder la goupille se termine sur les plaques en laiton.
10. Déposer l'extrémité en saillie de la vis.
11. Souder l'écrou à la vis. Veillez à ne pas souder l'écrou de la plaque de laiton.
12. Testez le mouvement de l'entraînement: tourner la vis aiguilles d'une montre pour élever le pont en plastique.

2. Préparation de la sonde de silicium

Avant de fixer la sonde sur le disque, ajouter de l'isolant supplémentaire pour la zone de liaison de la sonde pour éviter cerebrfluide ospinal (LCR) ou l'humidité de la production de courts-circuits:

1. Peser et mélanger les composants en élastomère Sylgard dans un rapport de 10:1.
2. Utilisation d'un applicateur de coton aiguisé, appliquer le Sylgard à l'extrémité supérieure de la sonde.
3. Laisser sécher dans un four préchauffé à 60 ° C pendant 2 heures.

Afin de s'assurer que les sites d'enregistrement sont dépourvues de tout débris, les pointes de sonde doivent être nettoyés:

4. Préparer une dilution de 4% de détergent CONTRAD.
5. Laissez tremper la sonde dans le détergent à 63 ° C pendant au moins 2 heures.
6. Rincez le détergent hors par trempage de la sonde à plusieurs reprises dans de l'eau distillée.

Avant de fixer la sonde sur le disque, l'impédance de chaque site d'enregistrement doivent être vérifiés:

7. Plonger la sonde dans une solution saline à 0,9%, et le connecter à une impédance-mètre. Si les sites d'enregistrement trop grand nombre ont une impédance incorrecte, répétez les étapes 2.4-2.6 ou envisager d'utiliser une sonde différente.Ici, nous utilisons un module de conditionnement Impédance de Frederick Haer, Co. (FHC), combiné avec un sélecteur de canal maison. Alternativement, un niPOD par NeuroNexus, Inc ou NanoZ par Neuralynx, Inc permet la surveillance de l'impédance de tous les canaux simultanément la sonde.

3. Apposition de la sonde pour le microdrive

1. Une lame de rasoir, découper des rainures multiples dans le pont pour créer une surface rugueuse.
2. Apposer la sonde à l'arête du disque. Cette procédure est préférable de faire en vertu d'un microscope opératoire, en tenant le lecteur avec une pince et d'ajuster la sonde par un micromanipulateur de sorte que les tiges sont parfaitement parallèles avec la vis d'entraînement. Cela garantit que pendant l'avancement, le passage de sonde tiges dans le tissu cérébral, sans "couper" à travers elle. La profondeur exacte des extrémités de la sonde par rapport à la base de l'entraînement doit être déterminée, à ce stade, en prenant en considération la profondeur de la structure cible à partir de la surface ducrâne.
3. La sonde est ensuite fixée sur le pont de ciment adhérence.
4. Facultatif: pour la visualisation de la piste de sonde dans le cerveau, la solution DiI (1-2% diluée dans de l'éthanol) peut être appliquée sur le dos de la sonde à ce stade.

4. Préparation du crâne

Avant la chirurgie, les électrodes de référence et au sol, et les parties de la cage de Faraday sur la tête sont préparés:

1. Découper deux pièces 2 "-longues de fil de cuivre, et à souder une extrémité de chaque fil de cuivre isolé pendant environ 1 mm.
2. En utilisant une aiguille, gratter la tête d'un 00-90, 1/8 "vis en acier inoxydable et de la soudure d'une seule pièce de fil de cuivre à lui. À souder ces aciers inoxydables au sol vis-électrodes nécessite un flux approprié (par exemple, N-3 tout usage de flux de La-Co) et des températures de bout de soudure. soigneusement empêcher toute soudure de s'écouler dans la gorge de la vis. ce sera utilisé comme électrode de masse. Répéter avec une autre vis et un fil de cuivre pour préparerl'électrode de référence.
3. Découpez des morceaux de filet trapézoïdale cuivre. Ces pièces seront assemblées pour protéger la headstage.

Les instruments chirurgicaux et la préparation sont les mêmes que ceux utilisés dans de nombreuses chirurgies pour petits animaux. La chirurgie est entièrement réalisée sous anesthésie profonde isoflurane, en utilisant des conditions aseptiques, selon NIH lignes directrices approuvées. S'il vous plaît noter que la chirurgie (maquette) montré dans cette vidéo est à des fins de démonstration uniquement. Pour des raisons de visibilité et de tournage appropriés, plusieurs étapes préparatoires, les précautions et procédures chirurgicales postopératoires ne sont pas affichées / visible ou discuté.

Avant la chirurgie, tous les composants et les fournitures doivent être stérilisés, en suivant les procédures appropriées (voir les Lignes directrices pour la chirurgie des rongeurs de survie; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf~~HEAD=NNS). Pendant la chirurgie, un champ stérile sur le crâne est préparé et isolé par des champs stériles. A la fin de la chirurgie, un antibiotique à large spectre est unpplied localement et un analgésique à action prolongée est administré par voie intramusculaire (par exemple, la buprénorphine, [Buprenex] 0,05 mg / kg). En outre, analgésique (par exemple, l'ibuprofène) est fourni dans l'eau potable à environ 60 mg/kg/24 heures pendant 5 jours. Pour appropriés des interventions chirurgicales et d'anesthésie, de consulter des sources appropriées ^12.

4. Installez l'animal dans l'appareil de stéréotaxie, de se raser et nettoyer le cuir chevelu ^13.
5. Couper la peau le long de la ligne médiane et repousser le cuir chevelu. Retirez le périoste, nettoyer et sécher le crâne.
6. Mesurez l'emplacement et la distance entre bregma et lambda, et de déterminer les coordonnées x et y du site d'implantation de sonde en conséquence l'aide d'un atlas stéréotaxique ^14. Marquez le site en grattant une croix sur le crâne avec un scalpel.
7. Percer le crâne à l'aide un peu à tête ronde de forage (taille ¼) et les vis de support d'entraînement (en acier inoxydable, 000-120, 1/16 ") à mi-chemin dans l'os, sur des plaques osseuses différentes sur le sommet d'unee sur le côté du crâne. Les vis fournir des ancres de manière sécurisée lier le casque sur le crâne.
8. Percez des trous au-dessus du cervelet et insérez le terrain et les électrodes de référence préparés à l'étape 4.2. Pour enregistrer les potentiels de champ locaux (LFP), le choix du site de référence est essentiel. Ce site est choisi en raison LFP cérébelleuse est la plus petite de toutes les régions corticales et des artefacts musculaires sont minimes à cet endroit la ligne médiane.
9. Appliquer dentine activateur (Metabond Kit) en utilisant une brosse minuscule sur toute la surface du crâne. Rincez avec une solution saline à 0,9%.
10. Appliquer le ciment dentaire (Metabond kit; suivre les instructions du fabricant pour le mélange) sur le crâne, couvrant soigneusement les vis d'ancrage et le sol et les électrodes de référence, mais en laissant le site d'implantation de sonde clair.
11. Fixez les volets quatre mailles de cuivre (préparé à l'étape 4.3) à la boîte crânienne. Pour cela, cimenter la base étroite de chacun d'entre eux au niveau antérieur, les côtés gauche, droit, et postérieure du crâne. Thcuivre e ne doit jamais être en contact direct avec l'os, mais toujours séparés par une couche de ciment.

5. Préparation de la surface du cerveau

1. Aide d'un foret à tête ronde, percer à travers le site d'implantation en plusieurs étapes, bien que fréquemment l'irrigation de l'os avec une solution saline.
2. Retirez délicatement le volet osseux et d'irriguer la surface du cerveau.
3. Pour insérer une sonde multi-tige, une large bande de dure-mère est enlevée. Deux outils sont nécessaires pour éliminer la dure-mère: un scalpel et d'un crochet préparé à partir d'une aiguille d'insectes (alternativement, une microélectrode de tungstène standard). Pliez la pointe de l'aiguille en poussant contre une surface dure (p. ex lame de microscope en verre), et l'attacher à une poignée (ici, un morceau de bois Q-tip, ou alternativement un porte-aiguille microdissecting).
4. Soulevez la dure-mère avec le crochet, et le couper avec un scalpel. Une attention particulière est prise pour éviter d'endommager la pie-mère, les navires et la surface du néocortex. Petits saignements peuvent être résoluspar une irrigation saline. Si le saignement majeur se produit ou le néocortex est compromise de quelque façon, on devrait envisager de mettre fin de la chirurgie et la préparation d'un autre animal.

6. Implanter la sonde

A ce stade, la densité et l'orientation des bâtiments de surface corticales sont soigneusement évalués. Coordonnées stéréotaxiques doit être ajustée, car la sonde doit pénétrer dans le cerveau dans une zone libre de plus grands navires.

Pour l'implantation, l'ensemble d'entraînement peut avoir lieu avec une pince crocodile fixé au support stéréotaxique. La visibilité ininterrompue de la surface du cerveau et les conseils de la sonde sont indispensables pour la pénétration réussie.

1. Abaissez lentement la sonde jusqu'à environ 1 mm au-dessus de la cible visée, tandis que l'irrigation en permanence la craniotomie avec une solution saline. Pour l'enregistrement du néocortex, les pointes de sonde sont descendus dans le cortex d'environ 0,5 mm et a levé en arrière près de la surface.
2. Sceller la craniotomie en appliquant un mélange chaud fondu d'huile cire et paraffine par le biais d'une aiguille (10-20g de cire dans 10 ml d'huile de paraffine, chauffé à 65 ° C). Avant l'application, refroidir le mélange à 30 ° C et de tester la densité. Il doit être suffisamment souple pour permettre le mouvement de sonde facile). Pour faciliter la couverture complète, le mélange peut être fondu in situ par l'approche de la cire durcie avec la pointe d'un micro-cauterizer.
3. Fixez le bas de la route sur le crâne avec du ciment adhérence, ayant soin de laisser l'écrou libre de tourner. Il est d'une importance capitale pour éviter tout accident "bosse" de l'entraînement à ce stade, sinon la sonde pourrait endommager le cortex. Après le lecteur est fixé sur le crâne, un mouvement régulier de la sonde doit être vérifiée.
4. Cimenter la partie de connecteur de la sonde par rapport au crâne.

7. Construction de la tête sur la cage de Faraday

1. Tirez vers le haut et d'assembler les rabats maille de cuivre dans un cylindre de protection autour de la sonde et drive. Le cylindre sert également un blindage électrique contre le bruit ambiant et les artefacts onde lente produits par les trichites chargées dans l'animal de se comporter.
2. Réglez la hauteur du cylindre en coupant les excès de matériau de sorte que le treillis de cuivre est de niveau avec le haut du connecteur de la sonde.
3. Souder les fils de la référence et vis de terre sur les broches appropriées du connecteur. Aussi soudure rabats adjacents maille de cuivre ainsi que d'assurer leur continuité électrique, et souder le fil de terre à la maille de cuivre.
4. Appliquer une couche de ciment emprise sur le treillis de cuivre pour le renforcer et à éviter tout contact direct entre le métal et la peau de l'animal. Eventuellement, appliquer une couche de résine époxy pour renforcer encore la chapellerie.
5. Tester le mouvement de la vis d'entraînement.
6. Couvrez le dessus du casque avec une pièce à couper à partir d'un gant en caoutchouc.

8. Enregistrement chez l'animal se déplaçant librement

1. Après appromangé soins post-opératoires, l'animal se connecter au système d'enregistrement en utilisant un headstage haute impédance et un poids léger, ultrasouple multi-brins du câble. Contrebalancer le poids du casque.
2. Testez la qualité d'enregistrement chaque jour dans le homecage. La position des sites d'enregistrement est jugé par les deux modes de tir unité et la forme des potentiels de champs locaux. Abaisser la sonde progressivement en tournant la vis par petits incréments (généralement 1/8-1/4 de tour par jour, soit 35-70 micromètres) jusqu'à ce que la structure cible est atteinte.

9. Les résultats représentatifs

Signaux électrophysiologiques (potentiel de champ local et unité d'activité) varient en fonction de la structure enregistrée et le comportement actuel de l'animal. La figure 1 montre des exemples de 32 canaux CA1 enregistrements hippocampe tandis que le rat est d'explorer un champ ouvert. Notez l'éminent 8 Hz (thêta bande) oscillation du potentiel de champ local lors de l'exploration avec superimposed dopage sur tiges et des sites multiples (des exemples de pointes indiquées par des flèches). Pour analyser l'activité neuronale unitaire, les pointes sont détectés et triés en unités simples en utilisant l'analyse de cluster de leurs formes d'onde ^15-16.

Figure 1. CA1 enregistrements hippocampe chez le rat en utilisant un comportement 4 jarrets de la sonde de silicium x 8 sites. Les enregistrements sont à large bande et échantillonné à 20 000 Hz, ce qui permet d'étudier les deux oscillations du champ locaux potentiels (par exemple "thêta" bande de 8 Hz rythme) et de l'activité neuronale de dopage.

Tableau 1. Alternatives aux réactifs et le matériel utilisés.

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Discussion

Ce film illustre la procédure d'implantation des sondes de silicium pour des affections chroniques à grande échelle des enregistrements chez le rat se comporter. Les étapes critiques afin d'assurer des enregistrements de qualité de l'activité neuronale proviennent de la fragilité à la fois biologique (tissu cérébral) et techniques (silicium sonde) matériaux. Une attention particulière doit être prise lors de la manipulation de la sonde pour éviter tout contact de la queue avec tout à distance ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom	Type	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Silicon sonde Buzsaki32, 4 x tiges 8 sites. Emballage: câble en polyamide flexible	Matériel	NeuroNexus	Sonde: buzsaki32 Emballage: HC32	La sonde d'enregistrement
Vis en laiton ronde, 00-90 x 1/2 vis en laiton rondes	Matériel	JIMorris	R0090B500	Partie d'entraînement
Écrou hexagonal en laiton, 00-90	Matériel	JIMorris	N0090B	Partie d'entraînement
Brass C260 bande, ASTM-B36 Épaisseur: 0.025 ", Longueur: 12", Largeur: 1/2 "	Matériel	Petites pièces	B000FMYU72	Partie d'entraînement
Connecteur tête, pas de 2mm, male, seule rangée, straigt, 36 postes	Matériel	Digikey	2163S-36-ND	Partie d'entraînement
2-partie Sylgard élastomère silicone	Matériel	Instruments de précision du monde	SYLG184	Pour isoler les extra-la sonde
Decon CONTRAD 70 Détergent liquide	Réactif	Fisher Scientific	04-355 Decon Laboratories N °: 1002	Pour nettoyer les sites d'enregistrement
Module de conditionnement Impédance	Équipement	FHC Inc	55-70-0	Impédancemètre
niPOD - 32 canaux	Équipement	NeuroNexus	niPOD -32	Impédancemètre
Ciment Grip Industrial Grade	Matériel	Caulk Dentsply	675571 (en poudre) 675572 (solvant)	Grip CEment
1,1 '-dioctadécyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate («DiI '; DiIC18 (3))	Réactif	Invitrogen	D282	Pour colorer la piste sonde dans le cerveau
Vis inox machine en acier, à tête bombée, d'entraînement fendue, # 00-90, 1/8 "	Matériel	Petites pièces	MX-0090-02B	Au sol et vis de référence
Fil de bobinage, 20G, le nylon-polyuréthane enduit, MW80	Matériel	Petites pièces	B000IJYRP2	Terre et le fil de référence
Vis inox machine en acier, à tête bombée fendue Drive, # 000-120, 1/16 "	Matériel	Petites pièces	MX-000120-01B	Vis d'ancrage
N-3 Tout liquide Flux but	Réactif	La-Co (Markal)	23512	Permet de souder en acier inoxydable
MicroGrid précision élargi de cuivre	Matériel	Dexmet	3 CU6-050 FA	Treillis de cuivre pour le tête cage de Faraday
C & B-Metabond rapide! Ciment système - la dentine Activator	Matériel	Parkell	S380
C & B-Metabond rapide! Système de ciment - ciment dentaire	Matériel	Parkell	S380
Forte aiguille de tungstène point et porte-	Outil	Instruments chirurgicaux Roboz	RS-6064 et RS-6061	Pour rendre le crochet pour soulever la dure-mère
Fraise en carbure de HP 1/4	Outil	Henry Schein	9990013
Paraffine (granulés)	Matériel	Fisher Scientific	P31-500
Huile minérale légère (NF / FCC)	Matériel	Fisher Scientific	O121-1
GC ELECTRONICS 10-114 adhésif époxy 2-Partie	Matériel	Newark	00Z416
Type 1 LITZ 21 AWG 40/36 Red polyuréthane mono-Nylon (MW80-C) à 0,041 "+ / -0.002" OD	Matériel	La Nouvelle-Angleterre Technologies Corporation fil	N28-36E-400-2	Pour rendre le câble entre le headstage et l'amplificateur
32-canaux headstage Very Large Scale Integration, 20x de gain	Équipement	Plexon	HST/32V-G20	Headstage