מתודולוגיה multiplexed Fluorometric immunoassay בדיקה ופתרון בעיות

Summary

שימוש בטכנולוגית microsphere Xmap של Luminex החברה, פתחתי immunoassay Fluorometric Multiplexed (MFIA) לserosurveillance של מיני בעלי חיים שונים במעבדה. MFIA הוא microarray השעיה בי אנטיגן, בקרת רקמה או נוגדנים קשורות קוולנטית לקלקר microspheres צבעים. שיטת בדיקת MFIA כמו גם נושאים שונים לפתרון בעיות מטופלות.

Abstract

כדי להבטיח את האיכות של מודלים של בעלי חיים המשמשים במחקר ביו פתחנו מספר האסטרטגיות ושיטות אבחון בדיקות כדי לקבוע אם בעלי חיים שנחשפו לחומרים מזהמים adventitious (וירוסים, Mycoplasma ומיקרואורגניזמים אנינים אחרים). זיהומים של מערכת חיסון בעלי חיים הם בדרך כלל חולפים, עדיין תגובות נוגדנים בסרום לזיהום לעתים קרובות ניתן להבחין בתוך ימים עד שבועות ונמשכים לכל אורך החיים של המארח. סרולוגיה היא מתודולוגיה האבחון הראשונית שבאמצעותו חיות מעבדה נמצאות תחת פיקוח. מבחינה הסטורית assay immunosorbent אנזים הצמוד העקיף (ELISA) כבר שיטת ההקרנה העיקרית לserosurveillance. ELISA מתבצעת כsingleplex, שבתגובת מיקרוביאלי 1 אנטיגן נוגדן נמדדת לטוב. בהשוואת MFIA מבוצע כבדיקת multiplexed. מאז microspheres לבוא ב100 ערכות צבעים שונות, רבים כמו 100 מבחנים שונים ניתן לבצע simultaneously בmicroplate האחת טוב. חידוש זה מקטין את הכמות בסרום, ריאגנטים ומתכלה הנדרשים לבדיקה שגרתית, תוך הגדלת כמות המידע המתקבל מבדיקה אחת טובה. בנוסף, אנו מסוגלים לשלב חרוזי בקרה פנימיים מרובים כדי לוודא מדגם והתאמת מערכת ובכך להבטיח את הדיוק של תוצאות. אלה כוללים שליטת רקמות ואימונוגלובולינים IgG נגד מבחן סרום מינים (αIg) ערכות חרוזים מצופות להעריך התאמתו מדגם. כמו בELISA וIFA, שליטת הרקמה מזהה מחייב הלא ספציפי של אימונוגלובולינים בסרום. שליטת αIg (שליטת סרום) מאשרת כי סרום כבר הוסיף ומכילה ריכוז נוגדני IgG מספיק תוך שליטת החרוז (שליטת התאמת מערכת), מצופה באימונוגלובולינים מיני סרום, מוכיח כי החומרים כימיים שהכותרת וLuminex הקורא מתפקדים כראוי.

Protocol

1. הסבר של נוהל MFIA (איור 1)

1. MFIA דורש אנטיגן קלקר microspheres של צ'ארלס ריבר המצופה (חרוזים), מבחן סרה, ריאגנטים כותרת (שקית, SPE) וחוצצים (ממס יסודי, מאגר Assay).
2. החומרים כימיים נוספים שלבים לבארות של 96-גם צלחות microtiter המסננים תחתונות.
3. MFIA מתבצע כincubations משמעות בדיקה הטרוגניות הם אחריו בצעדים מסננים לשטוף כדי להסיר מרכיבים לא כרוכים בסרום או שכותרת ריאגנטים. פתרון שטפים הוסיף לצלחת בארות יוסרה על ידי שאיפה דרך תחתית מסנן היטב, אשר שומרת את החרוזים.
4. מבחני MFIA מבוצעים בטמפרטורת חדר (27 ° C + / -2 המעלות צלזיוס).
5. קומפלקסי אנטיגן נוגדן שנוצרו במהלך שלב דגירת מבחן הסרום מזוהים על ידי incubations עם conjugates biotinylated העז נגד מינים (שקית) ואחרי streptavidin R-phycoerythrin מתויג-(SPE).
6. בקורא assay, החרוזים עוברים אחד בכל פעם דרךגלאי שבו הם חשופים לשני לייזרים. ליזר אחד שמרגש את הצבעים הפנימיים שמזהים את מערך הצבע של החרוז, אשר תואם את הבדיקה, והשני מרגש את צבע כתב phycoerythrin נתפס במהלך הבדיקה. מספר קבועים מראש של חרוזים נקראים לבדיקה ועוצמת phycoerythrin פלואורסצנטי מדווחת כמדד קרינת חציונים (MFI).

   
   איור 1. נוהל MFIA. MFIA Xmap המבוסס הוא microarray השעיה אשר מנצל 5.6 חרוזי קלקר בצבעי מיקרון שאנטיגנים (או ביקורת) מקושרים קוולנטית. מאז החרוזים באים ב100 ערכות צבעים שונות, רבים כמו 100 מבחנים שונים ניתן לבצע בצעדי Assay גם בודדים מתבצעים בצלחות microtiter מסנן מלמטה, כדי שניתן לכבס חרוזים על ידי שאיפה בסעפת ואקום. תגובות שלהם לקרוא עם 100 fluorometer Xmap Luminex. עוצמת phycoerythrin פלואורסצנטי מדווח כמדד פלואורסצנטי החציונית (MFI)

2. לפני תחילת עבודה נא לב לדברים הבאים:

1. חרוזי MFIA הם רגישים לאור
   1. להגביל את כמות אור החשיפה ישירה הוא קריטי. הכמות הנורמלית של חשיפה לאור המתרחשת במהלך בדיקות שגרתיות מקובלת אבל חשיפה ממושכת יכולה להוביל לphotobleaching של החרוזים ההופכים אותם לבלתי קריא על ידי קורא Assay.
   2. זה חיוני להצלחה של assay שחרוזי MFIA תמיד vortexed להשעיה ולאחר מכן sonicated (10-30 שניות) לפני שימוש.
   3. קורא Assay אוסף מידע מחרוזים בודדים בלבד. אשכולות חרוזים מצטברים יכולים להוביל יותר זמן לקרוא פעמים.

2. הקפד לשמור את צלחת הבדיקה מכוסית במכסת הצלחת בכל הצעדים כדי למנוע אידוי הדגירה של פתרוני assay.
3. ציוד מגן אישי הנדרשים: מעבדה מעיילת, GLoves, הגנה על עיניים צריכים להיות משוחקים בכל העת תוך כדי עבודה בסביבת מעבדה.

3. ריאגנטים

1. הטבלה 1 כוללת את רוב החומרים הדרושים להקמת מעבדת MFIA בבית. פריטים נוספים או כפולים עשויים להיות נחוצים בהתאם לצרכימים הספציפיים שלך. שים לב שמלאי זה אינו כולל חומרים כימיים שנרכשו מצ'ארלס ריבר (חרוזי MFIA, בקרות וריאגנטים נוספים). כמה מקורות מסחריים של conjugates biotinylated וphycoerythrin מתויג streptavidin זמינים. עם זאת בריאגנטים הזמינים מצ'ארלס ריבר כבר טיטרציה להניב איתות האופטימלית לניקוד רעש עם חומרים כימיים שלנו, תוך שימוש בספקים חלופיים או מגרשים מגיבים אינה מומלצת.

   טבלת 1. CR-RADS משתמש Reader מערך ההשעיה BioPlex מBioRad ומכונת כביסת microplate אוטומטית מBioTek. מכשור שווה ערך זמין מספקים חלופיים.

   פריט	מוכר	מספר קטלוגים
   ציוד
   קורא מערך השעיה	* BioRad	171-000205
   96-גם מכונת כביסת microplate	BioTek	ELX50/8FMW
   שואב קולי / אמבטיה	הקול פאלמר	EW0884900
   מיקסר אנלוגי מערבולת	VWR	58816-121
   -20 ° C מקפיא	שונה
   4 ° C מקרר	שונה
   ערוץ 12-pipettor, 20-200μl	VWR	83009-718
   Orbital הצלחת שייקר	VWR / מעבדת קו	57019-600
   פיפטורים ערוץ יחיד, 20-200μl, עם טיפים	VWR	83009-732
   פיפטורים מסך, 2-20μl, עם טיפים	VWR	83009-726
   פיפטורים ערוץ יחיד, 100-1000μl, עם טיפים	VWR	83009-736
   מכשיר האוורור Vacushield	VWR	55095-006
   משאבת לחץ ואקום	VWR	54908-037
   מאגר פסולת מערכת ואקום	VWR	80200-640
   Disposables
   צלחת polystryrene 96-היטב	הפישר סיינטיפיק	14-245-145
   Multiscreen HTS-BV צלחת, 1.2μm מסנן, סטירן	Millipore	MSBV N12 50
   15 מיליליטר צינורות חרוטים (פוליפרופילן)	Sarstedt	62554.002
   50 מיליליטר צינורות חרוטים (פוליפרופילן)	Sarstedt	62547.004
   בקבוקוני סרום	Sarstedt	72694.007
   רדיד אלומיניום	VWR	89079-068
   בקבוקי 1 ליטר, סטרילי	VWR	28199-246
   מסנני 0.22μm בקבוק עליון	VWR	28199-307
   מאגרים מגיבים (100 מ"ל)	VWR	82026-356
   5 מ"ל, 10 מ"ל, pipets 25ml לניפוק ריאגנטים נוזליים	VWR
   ריאגנטים
   PBS, pH 7.4 1 BSA, אבקה (שקיות)	סיגמא	P3813
   ProClin 300	סיגמא / Supelco	48912-U
   ללא ציפוי microspheres	Luminex	השתנה בהתאם לסוג

4. הכנת ריאגנט

1. שני חוצצים נדרשים להליך MFIA. הממס ראשוני הוא זמין מצ'ארלס ריבר ומכיל סוכני חסימת קנייניות כדי להקטין אינטראקציות חלבון שאינם ספציפיות. חיץ לשטוף assay נעשה במתקן שלך עם חומרים כימיים מסחרי קיימים.
2. Assay לשטוף חיץ: 1% חומציות PBS / BSA 7.4 זמין כאבקה מסיגמה אולדריץ.
   1. ההסרה של חלקיקים על ידי סינון היא קריטית כמו חלקיקים אלה יכולים להוביל לסתימות בקורא assay. סנן החיץ דרך בקבוק עליון יחידת מסנן 0.2micron ל, מכולות סטריליים שכותרתו.
   2. התיק וSPE בדילול לריכוז עבודת 2X בחיץ לשטוף Assay. הערה: SPE הוא רגיש לאור וshולד יש חשיפת אור מוגבלת.

5. לדוגמא הכנה

1. להרכיב חומרים שלך לבדיקה, ריאגנטים והציוד מתכלה.
   1. micropipettes וטיפים Multi-וערוץ אחד
   2. צלחות גם 96-נמוכות חלבון מחייבות microtiter (דילולי סרום) וצלחות מסננות תחתונות (assay MFIA)
   3. איסוף דגימות דם לפי הנוהל הרגיל שלך. לאפשר את דגימות הדם להיקרש באופן מלא על ידי החזקתן בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות לפחות לפני צנטריפוגה והסרת סרום. סרום Undilute יש vortexed בקצרה לערבב את המרכיבים לפני דגימת הדם.
   4. דילול הבדיקות הסופית לMFIA הוא 1/50. זה הכרחי כדי להפוך את מדגם 2X (1/25) של סרום הבדיקה שלך לבדיקה. דלל את סרום מבחן דילול המלא על ידי הוספת חלק 1 סרום לממס 24 חלקי MFIA ראשי. ארגון סרום הבדיקה שלך בצלחת microtiter 96-גם מקטין באופן משמעותי את זמן העברת הדגימות שלך לtesצלחת ולא מומלצת בחום.

6. הכנת צלחת מבחן

1. הרטבת Pre-96-מבחן הצלחת גם נדרשה כדי להבטיח, גם כן פינוי ראוי. גם אם כל הצלחת לא ישמש צעד זה נדרש בתחילה, אתה לא צריך להוסיף מגיב או לאחר מכן לשטוף חיץ לבארות הריקות.
   1. מעבדות החלק להפעיל פחות מצלחת מלאה 96-היטב על ידי אטימת בארות שאינן בשימוש על צלחת הניסוי והתכנית לחזור ולהשתמש בארות אלה במועד מאוחר יותר. אנו לא ממליצים על שימוש בשיטה זו משום שהיא עלולה להשפיע על הסינון הנכון של צלחת הבדיקה.

2. שאיפת צלחת מבחן ראויה היא חיונית להצלחה של assay MFIA. פינוי בארות המדגם צריך לקחת כ 5-10 שניות. Aspirating את התוכן גם במהירות רבה מדי יכול להוביל לצבירת חרוז וזמנים לקרוא איטיים בסוף הבדיקה.
3. תמחה התחתון של צלחת בדיקה עם מגבות נייר לאחר כל wצעד אפר כדי להבטיח ניקוז נוזל הפסיק. אי ימחה את צלחת הבדיקה יכול להוביל לריאגנטים נוזליים פתילה מתוך את הבארות במהלך דגירה ותוצאה באי מינים אנטי עיזים ועשרות מיני IgG חרוז / או. חרוזים אלה נועדו לציון בטווח שנקבע מראש MFI כאשר הכמות המתאימה של סרום עיקרי וריאגנטים התוויות נוספות לכל גם.

7. הכנת השעית חרוז MFIA

1. זה חיוני להצלחה של assay שהחרוזים תמיד vortexed וsonicated לפני השימוש. קורא assay אוסף מידע מחרוזים בודדים בלבד, אגרגטים או גושי חרוזים יכולים להוביל לעוד לקרוא פעמים.
2. מערבולת המניות יחד השעית חרוז (בדרך כלל 10 ± 5 שניות)
3. Resuspend את החרוזים אחרי sonication באמבט sonicator ל10-20 שניות.
4. לדלל את השעית מניית 20X להשעית חרוז 2X עובד בממס ראשית. לוותר 50μl של השעית חרוז 2Xלכל assay גם של פלייט המבחן מראש הרטוב.

8. תוספת של סרה בדיקה ובקרה לבדיקת פלייט

1. פיפטה 50μl כל בדיקה ובקרת סרום לצלחת המבחן המבוססת על מפת הצלחת המוגדרת מראש שלך 2X. מכסה מאובטח לצלחת עם גומייה או נייר אלומיניום ודגירת פלייט המבחן ל60minutes בהקפת שאכר, בחושך בטמפרטורת חדר.
   1. המהירות שייקרה צריכה להיות גדולה מ 400 אך פחות מ 700rpm. זה קריטי, כי החרוזים יישמרו בהשעיה כדי לאפשר לנוגדנים בסרום לגשת לכל המשטחים של אנטיגנים יחד. כישלון לשמור על החרוזים מושעים יגרום ציונים נמוכים בקרת IgG חרוז והבדיקה תהיה צורך לחזור.

9. כביסת פלייט המבחן

1. לשאוב את התוכן גם באמצעות סעפת ואקום. פינוי בארות המדגם צריך לקחת כ 5-10 שניות.
2. תמחה תחתון של צלחת הבדיקה עם Papeמגבות r לאחר כל כדי להבטיח ניקוז נוזל הפסיקו.
3. Resuspend את החרוזים ב50μl של חיץ לשטוף Assay. חשובים שהחרוזים אינם מורשים יתייבשו במהלך תהליך הבדיקה.

10. הוספת תיק וSPE לצלחת המבחן

1. לוותר 50μl תיק של דילול עובד 2X לכל הבארות המכילות חרוזי MFIA. לאבטח את המכסה לצלחת עם הגומייה או נייר אלומיניום. דגירת צלחת המבחן ל30minutes עם רועד כאמור לעיל, בחושך בטמפרטורת חדר.
   1. לאחר הדגרה זה לשטוף את צלחת המבחן וresuspend את החרוזים עם חיץ לשטוף Assay כפי שתוארה קודם לכן בעקבות בנוסף סרום.

2. לוותר 50μl של SPE הדילול עובד 2X לכל הבארות המכילות חרוזי MFIA. לאבטח את המכסה לצלחת עם הגומייה או נייר אלומיניום. דגירת צלחת המבחן ל30minutes עם רועד כאמור לעיל, בחושך בטמפרטורת חדר.
   1. לאחר incu זהbation לשטוף את צלחת המבחן וresuspend את החרוזים עם 125μl של חיץ לשטוף Assay ולנער את הצלחת ל~ שתי דקות לresuspend את החרוזים לפני הצבת לקורא assay.

11. קריאת פלייט המבחן

1. הנח את צלחת המבחן לקורא assay תוך 10 דקות של resuspending את החרוזים. במקרה של הפסקת חשמל או אירוע אחר, פלייט המבחן יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת חדר בחושך עד 12 שעות עד מוכן לקריאה.
   1. שים לב לדוגמא הראשונה גם כדי לוודא שפנל החרוז נבחר תואם את פרופיל החרוז בבארות הבדיקה. אם יש חרוזים נופלים מחוץ "אזור החרוז" המיועד שלהם בתצוגת הפרוטוקול, בחירת פרופיל נכונה נעשתה.
   2. אם את החרוזים כבר resuspended כראוי הם צריכים למלא ב'האזורים 'שצוינו מצוינים בתוכנת קורא assay.
   3. אם את החרוזים הם מגובשים הם ימלאו באזורים שלהם באיטישיעור. אתה יכול להסיר את צלחת הבדיקה מהקורא וידני resuspend את הבארות. כל Triturate היטב עם pipettor רב ערוצית 3-4 פעמים כדי לסייע בפירוק מצרפי החרוזים. החלף את צלחת המבחן לקורא ולהמשיך.

12. נציג תוצאות

1. מספר מינימאלי של חרוזים נקראים לבדיקה ועוצמת phycoerythrin פלואורסצנטי מדווחת כמדד קרינת חציונים (MFI) נע בין 0 ל 32667. לאחר השוואת סעיפים של 25, 50 או 100 לחרוזים גם לא ראו שום הבדל סטטיסטי ובאופן שגרתי לספור 25 חרוזים לסוכן לדגימה היטב. בדוק את דוח התוצאות לשגיאות, כגון ספירת חרוזים לקויה או נכשל ציונים נגד IgG חרוזי IgG /. חרוזים אלה נועדו "ציון" בטווח MFI שנקבע מראש, כאשר הכמות המתאימה של סרום עיקרי וריאגנטים התוויות נוספות לכל גם. בארות לדוגמה, עם טעויות (ספירת חרוזים נמוכה) או תוצאות כושלות IgG בקרת חרוזים צריכיםיחזור על עצמו לרכוש תוצאות תקפות.
2. לייצא את התוצאות לגיליון עבודה של Excel. לנתונים לפרשנות שלנו כל assay מוקצה:
   1. רקמות בקרה של ניסוי (TC): עבור רוב מבחני MFIA מכרסמים, שליטת הרקמה היא תמצית של תאי חרקי סוג פראי baculovirus-נגועים.
   2. מפסק Assay: ערך זה הוא את הקרינה המינימאלית הצפויה ומותאם לכל assay כדי למקסם את דיוק אבחון. עבור רוב המבחנים, הפסקת פלואורסצנטי היא 3000.

3. אינדקס קרינת חציונים נקי (MFI) מחושב לכל בדיקה (למעט בדיקות IgG בקרה ורקמות) על ידי הנוסחא הבאה. במילים אחרות, את אות הבדיקה הספציפית היא הבדיקה הכוללת MFI מינוס TC (רקע) MFI אז ערך זה מחולק על ידי 1000 שפשוט מגדיר את הטווח של בין 0-32 MFI הנקי במקום 0-32,667.
   

   נקי MFI = _(Assay MFI _נוגדן - _{בקרת רקמות} MFI) / 1000

   Neלא MFI וTC MFI מומרים לציונים בהשוואה למפסק Assay הספציפי לכל אנטיגן.

   

   
   איור 2. נתונים מייצגים MFIA למבחן סרום עם כל IgG שולט חולפים.

4. 12.4 פרשנות MFIA
   1. תוצאות בדיקת פלייט יש לפרש רק אם מערכת הבקרה-התאמה ובקרת סרום (IgG / חרוזים אנטי IgG) תוצאות עומדות בקריטריונים לקבלה המפורטים בטבלה 2. כישלון של שני חרוזי בקרת IgG האלה יכול להצביע על כמה טעויות פרוצדורליות כגון דילול לא נכון או הצמוד נפח מספיק או דילול SPE, בלתי נאות בדיקת סרום או שימוש בסרום מחית immunocomprimised.

      טבלה 2

      קריטריוני קבלה לבקרת Assay
      לשלוט	תוצאה מקובלת
      	ציון	מיון
      טווח גבוה חיסוני סרום	≥ 4.5	חיובי
      טווח נמוך חיסוני סרום	≥ 1.5	≥ גבולי
      סרום ללא חיסון	<2.5	≤ גבולי
      Diluent	<2.5	≤ גבולי
      איג חרוז גדר *	≥ Cutoff/1000	לעבור

      * חרוז להגדיר מצופה באימונוגלובולינים ספציפיים למין אנטי מבחן סרום (איג): ציונים כושלים לשליטה התאמת מדגם זה יכולים להיגרם כתוצאה מתוספת של מדגם מספיק, גבוה מדי דילול מדגם, מינים שגויים או סרום מבדיקות הו immunodeficientst.

   2. אם כל אחד מפקדי Assay פלייט הבדיקה להיכשל מלבד הסרום חיסוני הטווח הגבוה, התוצאות הן לא מקובלות ויש לחזור. ציון עובר נמוך טווח סרום בקרה הוא קריטי שכן הוא מדגים את רמת רגישות זיהוי של צלחת הבדיקה.
   3. ציון עיזים אנטי מיני IgG החרוז מבוסס על כמות סרום מבחן עיקרי נוספת לבדיקה. אם שליטת חרוז זה נכשל אבל מיני IgG עובר (טוב B1, איור .3) אז זה מצביע על כך שחומרים כימיים בדיקה מספיק (שקית, SPE) נוספו למבחן היטב וזה נושא קשור בסרום. אם כמות ריאגנטים בדיקה אינה מספיק מסוים גם הוא IgG וחרוזי בקרה אנטי IgG ייכשלו (טוב E1, איור .3).

      
      איור 3. נציג תוצאות MFIA בדיקה עם כישלונות (שצוין בכתום). הוולס A1, C1 ו F1 מצביעים על כשל TC (reactive רקמה)בי ציון TC מיוצג בסוגריים. הוולס B1 ו E1 להמחיש את שני סוגים של כשלי IgG בקרה הפנימיים, בדיקת נוגדנים מספיקים (B1) או ריאגנטים בדיקה (E1) בהתאמה שקית / SPE.

   4. אם תוצאות בדיקת בקרת Assay פלייט הן משביעי רצון, ציוני assay פרט מסווגים, כפי שמוצגים בטבלה 3. זה קריטי כדי לאשר כל ממצא גבולי או חיובי, על ידי שיטת בדיקה חלופית.

      טבלה 3

      סיווג ציון MFIA
      ציון			מיון
      TC	נקי	TC + * נקי
      ≥ 2	<0.5	<2.5	שלילי (-)
      	≥ 0.5	≥ 2.5	תגובת TC (ט)
      <2	<1.5		-
      	1.5 ≤ X <2.5		גבולי (ב ')
      	≥ 2.5		חיובי (+)

      * סיווג שלילי עדיין יכול להיקבע עם ציון TC אינו אפס ספק TC + ציון נקי (= ציון Ag) הוא שלילי

Discussion

תהליך בדיקת MFIA הוא יעיל ביותר, ודורש פחות ציוד ומדגם קטן יותר ומגיב יותר מכרכי בדיקות singleplex מסורתיות. הפונקציונליות של המערכת זמנית נותנת למשתמש את הגמישות למסך בו זמנית לזנים מרובים או זנים של סוכנים נפוצים במכרסמי מעבדה (קורונה כלומר, parvoviruses וכו '). זה גם מאפשר לנו, לעצב פנלי חרוזים מותאמים אישית המבוססים על תחומי העניין (משפחת הווירוס ספציפי אני.) וניתן להתאמה לסוגי ההקרנה אחרים של ביומולקולות כולל ציטוקינים וסמנים ביולוגיים אחרים. בנוסף, היא מאפשרת לנו לשלב כמה מבחני בקרה פנימיים כדי לוודא מדגם והתאמת מערכת ובכך להבטיח את הדיוק של תוצאות. אלה כוללים שליטת רקמות ואימונוגלובולינים IgG נגד מבחן סרום מינים (αIg) ערכות חרוזים מצופות להעריך התאמתו מדגם. רקמת שליטת חרוז מזהה מחייב הלא ספציפי של אימונוגלובולינים סרום ושליטת αIg החרוז מאשרסרום שנוסף לו ומכיל ריכוז נוגדנים מספק. שליטת חרוז אחר, מצופה באימונוגלובולינים מיני סרום, מוכיח כי החומרים כימיים שכותרתו וקורא assay מתפקדים כראוי. מבחנים אחרים זמינים מסחרי זמנית בפורמט סרולוגיות (microarrays ie., ImmunoComb) לא יכולים להציע רמה זו של אישור תוצאה.

היכולת לצמצם את המקור האפשרי לכישלון בדיקה לפני הבדיקה חוזרת יכולה לעזור חוקר לחסוך בזמן וחומרים. היבטים קריטיים של MFIA צריכים להיות מאושרים לפני חזרה מדגם נכשל. מאז הבדיקה מתבצעת בטמפרטורת סביבתו יש לוודא כי טמפרטורת המעבדה היא כ 27 ° C ± 2 מעלות צלזיוס, טמפרטורות גבוהות יותר יכולות להוביל לציונים נמוכים מצפויים לפקדים ודגימות. כביסה היא אולי השלב הקריטי ביותר בבדיקה. הם מבטיחים שצלחת המבחן היא שטפה כראוי, ומחק resuspended יכול לחסלהרוב המכריע של טעויות דגימה עקב ספירה נמוכה של חרוז (עקב חרוזים צבורים) או בנוסף מגיב מספיק (אבד ידי פתילה מתחתית מסנן צלחת בדיקה). אנו שגרתי לספור 25 חרוזים לבדיקה (סוכן) ולא מצאנו כל הבדל סטטיסטי בתוצאות על ידי ספירת מספר גבוה יותר של חרוזים שגם יובילו לזמן לקרוא עוד על הצלחת.

יש לנו מחקרים שבוצעו אימות מקיפות של MFIA בכמה מינים של חיות מעבדה בשימוש נפוץ (עכבר, חולדה, אוגר, קביה וארנב) להפגין דיוק אבחון, שחזור, וקשיחות על ידי בדיקת מספר גדול של דגימות ידועות חיוביות ושליליות בסרום, ו השוואתם ELISA, תוצאות MFIA IFA ו. את מגבלות זיהוי (כלומר, נקודתי קצה טיטרציה רגילות חיסוניות סרום) של MFIA היו דומות ל, ובמקרים מסוימים עלו, אלה של ELISA המקביל. סגולי לאבחון, למדידה עם SPF מכרסם סרה, עלה 99%; betwee ההתכתבות הכלליתn ELISA וMFIA בוצעו על סרום ידוע חיובי ושלילי ידוע היו גדול יותר מאשר 95%. לסיכום, תוצאות המחקר הוכיחו כי MFIA זמנית היא חלופי טוב singleplex ELISA, והוא מתאים לשימוש, כלומר המיועד שלו בserosurveillance השגרתי של מושבות בעלי חיים במעבדה.