Мультиплексированный Флуорометрический Методология тестирования иммунологического анализа и устранение неисправностей

Резюме

Использование Xmap микросфер Luminex корпорации технологии, мы разработали Мультиплексированный Флуорометрический иммуноферментного анализа (MFIA) для серологического различных видов лабораторных животных. MFIA представляет собой суспензию микрочипов, где антиген, управление ткани или иммуноглобулины, которые ковалентно связаны с цветными полистирольных микросфер. Метод MFIA тестирования, а также различные важные темы рассматриваются.

Аннотация

Для обеспечения качества животной модели, используемые в биомедицинских исследований мы разработали ряд диагностических стратегий тестирования и методов, чтобы определить, если животные были подвержены случайным инфекционные агенты (вирусы, микоплазмы и других прихотливых микроорганизмов). Инфекции иммунокомпетентных животных, как правило, преходяще, но сыворотке антител к инфекции часто могут быть обнаружены в течение нескольких дней до нескольких недель и сохраняется на протяжении всей жизни хозяина. Серология является основной диагностической методологии лабораторных животных, которые контролируются. Исторически косвенные иммуноферментного анализа (ИФА) была основным методом скрининга для серологического. ELISA выполняется как singleplex, в которых один микробной реакции антиген-антитело измеряется на лунку. По сравнению MFIA выполняется как мультиплексированных анализа. Поскольку микросферы пришел в 100 различных наборов цветов, целых 100 различных анализов могут быть выполнены Simultaneously в одну лунку. Это новшество уменьшает количество сыворотки, реагенты и расходные материалы необходимые для рутинного тестирования в то время как увеличение количества информации, полученной от одного теста хорошо. Кроме того, мы можем включить несколько внутренних бисером контроля для проверки образца и пригодности системы и тем самым обеспечить точность результатов. Они включают в себя управление ткани и IgG анти-тест сывороточных иммуноглобулинов видов (αIg) покрытием борта наборы для оценки пригодности образца. Как и в ИФА и РИФ, ткани управления обнаруживает неспецифического связывания сывороточных иммуноглобулинов. Контроль αIg (контроль сыворотки) подтверждает, что сыворотка была добавлена ​​и содержит достаточной концентрации иммуноглобулинов IgG, в то время как контроль шарик (контроль пригодности системы), покрытые сывороточных иммуноглобулинов видов, показывает, что меченые реагенты и Luminex читателя функционируют должным образом.

протокол

1. Объяснение процедуры MFIA (рис. 1)

1. MFIA требует Charles River в антигенным покрытием полистирольных микросфер (бисер), тест сыворотки, обозначенные реагентов (BAG, SPE) и буферы (первичный разбавитель, анализа буфера).
2. Реагенты добавляются поэтапно в лунки 96-луночных фильтр нижней пластин микротитрования.
3. MFIA выполнена в виде гетерогенных инкубации смысл теста следуют фильтр промывания для удаления несвязанных компонентов сыворотки или маркированы реагентов. Промывочный раствор добавляют к пластине скважины удаляют отсасыванием через фильтр а-клеш, которые сохраняют бисера.
4. MFIA анализы проводили при комнатной температуре (27 ° C + / -2 ° C).
5. Комплексы антиген-антитело образуются в ходе испытания сыворотки стадии инкубации обнаруживаются инкубации с биотинилированного козьего анти-вид конъюгатов (BAG), а затем R-фикоэритрин-меченым стрептавидином (SPE).
6. В анализе читатель, бисер проходят по одному черезДетектор, где они подвергаются воздействию двух лазеров. Один лазерный возбуждает внутренние красители, которые определяют набор цветов шарик, который соответствует анализа, другой возбуждает фикоэритрин красителя репортера, захваченных во время анализа. Заданное количество бусин читается в анализе и интенсивность флуоресценции фикоэритрин сообщается как о Медиана индекса флуоресценции (MFI).

   
   Рисунок 1. MFIA процедуры. Xmap основе MFIA представляет собой суспензию микрочип, который использует цветной полистирол 5,6 микрона бисером которые антигенов (или контроля) ковалентно связаны. С бисером приходят в 100 различных наборов цветов, целых 100 различных анализов могут быть выполнены в одном и шаги Анализ проводится в фильтре нижней пластин микротитрования так, что бисер можно мыть стремление на вакуумном многообразии. Реакция читаются с Luminex Xmap 100 флуорометре. Интенсивность phycoerytГРИН флуоресценции сообщается как средний индекс флуоресценции (MFI)

2. Перед началом установки обратите внимание на следующее:

1. MFIA бисер светочувствительных
   1. Ограничение количества прямого воздействия света имеет решающее значение. Нормальное количество освещенности, которое происходит во время рутинного тестирования является приемлемым, но длительное воздействие может привести к фотообесцвечивания из бусин, которые делают их чтения в Пробирной читателя.
   2. Это имеет решающее значение для успеха анализа, что MFIA бисер всегда встряхивают в подвеску, а затем обрабатывали ультразвуком (10-30 секунд) до использования.
   3. Анализ читатель получает информацию от одного только бисера. Сводные борта кластеров может привести к увеличению читал раза.

2. Будьте уверены, чтобы сохранить испытательной пластины покрыты пластины крышкой в ​​течение всего инкубационного шаги, чтобы избежать испарения анализа решений.
3. Средства индивидуальной защиты необходимы: Лаборатория пальто, GLoves и защиты глаз следует носить все время при работе в лабораторных условиях.

3. Реагенты

1. Таблица 1 включает в себя большую часть материалов, необходимых для создания в доме MFIA лаборатории. Дополнительная или повторяющиеся элементы могут быть необходимы в зависимости от ваших конкретных потребностей. Обратите внимание, что этот перечень не включает реагенты приобретены у Charles River (MFIA бисера, контроль и дополнительные реагенты). Несколько коммерческих источников биотинилированных конъюгатов и стрептавидин отмеченных фикоэритрин имеются. Однако реагенты доступны из Charles River были титровать для получения оптимального сигнала к шуму счеты с нашими реагентами, использование альтернативных поставщиков или реагента много не рекомендуется.

   Таблица 1. CR-RADS использует Биоплексы чтения массива Отстранение от BioRad и автоматизированная машина планшет от BioTek. Эквивалентная приборов можно получить альтернативный поставщиков.

   Пункт	Продавец	Номер в каталоге
   Оборудование
   Читатель Подвеска массива	* BioRad	171-000205
   96-луночных микропланшетов шайбы	BioTek	ELX50/8FMW
   Ультразвуковой очиститель / ванной	Cole Palmer	EW0884900
   Аналоговый микшер вихревой	VWR	58816-121
   -20 ° C морозильнике	Различный
   4 ° C холодильнике	Различный
   12-канальная пипетка, 20-200 мкл	VWR	83009-718
   Орбитальный шейкер	VWR / Lab-Line	57019-600
   Одноканальные пипетки, 20-200 мкл с наконечниками	VWR	83009-732
   Одноканальные пипетки, 2-20 мкл, с советами	VWR	83009-726
   Одноканальные пипетки, 100-1000 мл, с советами	VWR	83009-736
   Vacushield вентиляционные устройства	VWR	55095-006
   Вакуумный насос давления	VWR	54908-037
   Вакуумная система отходами водохранилище	VWR	80200-640
   Одноразовые
   96-а polystryrene пластины	Fisher Scientific	14-245-145
   MultiScreen HTS-BV пластины, 1.2μm фильтр, стирола	Millipore	MSBV N12 50
   15 мл конических пробирок (полипропилен)	Sarstedt	62554.002
   50 мл конических труб (полипропилен)	Sarstedt	62547.004
   Сыворотка флаконах	Sarstedt	72694.007
   Алюминиевая фольга	VWR	89079-068
   1L бутылки, стерильный	VWR	28199-246
   0.22μm бутылочных фильтры	VWR	28199-307
   Реагент водоемов (100 мл)	VWR	82026-356
   5 мл, 10 мл, 25 мл пипетки для дозирования жидких реагентов	VWR
   Реагенты
   PBS, рН 7,4 1 BSA, порошок (пакеты)	Сигма	P3813
   ProClin 300	Sigma / Supelco	48912-U
   Без покрытия микросфер	Luminex	варьироваться в зависимости от типа

4. Подготовка реагентов

1. Два буфера, необходимых для процедуры MFIA. Первичный Разбавитель доступна реки Чарльз и содержит конфиденциальную блокаторы для уменьшения неспецифических взаимодействий белков. Анализ буфера Wash сделан на вашем предприятии с помощью коммерчески доступных реагентов.
2. Анализ промывочного буфера: PBS / 1% BSA рН 7,4 выпускается в виде порошка от Sigma-Aldrich.
   1. Удаление твердых частиц путем фильтрации имеет решающее значение, поскольку эти частицы могут привести к засорению в анализе читателя. Фильтр буфера через 0.2micron бутылку-топ фильтр в стерильные, маркированные контейнеры.
   2. Сумки и SPE разводят их 2X рабочей концентрации в буфере для анализа Wash. Примечание: SPE является светочувствительным и шульд имеют ограниченный освещенности.

5. Подготовка проб

1. Соберите тестирования материалов, реагентов и расходных материалов.
   1. Multi-и одноканальные пипетки и советы
   2. 96-а низкое связывание белка микротитровальных пластинах (сыворотка разведения) и фильтр-нижней пластины (MFIA анализ)
   3. Соберите образцы крови в соответствии с вашими стандартная процедура. Разрешить образцы крови к свертыванию полностью, удерживая их при комнатной температуре в течение по крайней мере 30 минут до центрифугирования и удаления сыворотки. Undilute сыворотки следует перемешать кратко смешать компонентов сыворотки до отбора проб.
   4. Конечное разведение тестирование на MFIA это 1/50. Это необходимо сделать 2X (1/25) образец тестовой сыворотки для анализа. Развести неразбавленном сыворотки теста, добавляя 1 часть сыворотки до 24 частей MFIA первичного разведения. Организация тестовой сыворотки в 96-луночный планшет значительно сокращает время передачи ваших образцов для ТЭСт плиты и настоятельно рекомендуется.

6. Подготовка испытательной пластины

1. Предварительное смачивание 96-а тест пластины, необходимые для обеспечения правильной, даже хорошо эвакуации. Даже если вся пластинка не будет использоваться этот шаг изначально необходимо, вам не придется добавлять реагент или последующее мытье буфера в пустых скважин.
   1. Некоторые лаборатории работать меньше, чем полный 96-луночный планшет, закрыв неиспользованных скважин на тарелку испытаний и план повторное использование этих скважин на более поздний срок. Мы не рекомендуем использовать этот метод, так как это может повлиять на надлежащее фильтрации тест пластины.

2. Правильное стремление пластины теста имеет решающее значение для успеха анализа MFIA. Эвакуация образца скважины займет около 5-10 секунд. Аспирационные а содержание слишком быстро может привести к борту агрегации и медленно прочитал раз в конце анализа.
3. Пятно нижней пластины теста с бумажным полотенцем после каждых Wзолы шагом для обеспечения слива жидкости остановился. Невыполнение промокните испытательной пластины может привести к жидкими реагентами влагу из скважины во время инкубации и в результате отсутствии козьего анти-видов и / или видов IgG борта баллов. Эти шарики предназначены для оценки в течение заранее определенного диапазона MFI, когда соответствующее количество первичных сыворотки и надписью реагенты добавляют в каждую лунку.

7. MFIA бисера приготовления суспензии

1. Это имеет решающее значение для успеха анализа, что шарики всегда встряхивают и обрабатывают ультразвуком до использования. Анализ читатель получает информацию от одного только бисера, бисер агрегатов или сгустки могут привести к увеличению читал раза.
2. Vortex фондовом связанных шарик подвески (обычно 10 ± 5 секунд)
3. Ресуспендируют бисером следуют ультразвуком в ванне ультразвуком в течение 10-20 секунд.
4. Развести 20-кратный запас подвески 2X рабочего борта подвески в начальной разведения. Внесите 50 мкл 2X шарик подвескидля каждого анализа и предварительного мокрого теста плиты.

8. Добавление Sera испытаний и управления в испытательной пластины

1. Внесите 50 мкл каждого 2X и контрольной сыворотки для теста плиты на основе ваших предопределенных карте пластины. Безопасная крышка к пластине с резинкой или алюминиевую фольгу и выдержать тест Пластина для 60 минут на орбитальном шейкере, в темноте при комнатной температуре.
   1. Скорость шейкере должно быть больше 400, но меньше, чем 700rpm. Очень важно, чтобы бусины иметь в подвеску, чтобы сывороточных антител доступ ко всем поверхностям связанных антигенов. Неспособность сохранить бисера приостановлено приведет низкие показатели IgG борта контроля и анализа должны быть повторены.

9. Стиральные испытательной пластины

1. Аспирируйте а содержимое с помощью вакуумного коллектора. Эвакуация образца скважины займет около 5-10 секунд.
2. Пятно нижней части испытательной пластины с ПапеГ полотенца после каждого для обеспечения слива жидкости остановился.
3. Ресуспендируют бусины в 50 мкл буфера для анализа Wash. Важно, чтобы шарики не высыхать во время теста процесс.

10. Добавление сумку и SPE на испытательной пластины

1. Внесите 50 мкл 2X рабочем разведении мешок, чтобы все лунки, содержащие MFIA бисера. Закрепите крышку к пластине с резинкой или алюминиевой фольгой. Инкубируйте пластины теста в течение 30 минут при встряхивании, как указано выше, в темноте при комнатной температуре.
   1. После этой инкубации промыть испытательной пластины и ресуспендируют бусины с анализа буфера Wash, как описано ранее после того сыворотки.

2. Внесите 50 мкл 2X рабочем разведении SPE для всех лунках, содержащих MFIA бисера. Закрепите крышку к пластине с резинкой или алюминиевой фольгой. Инкубируйте пластины теста в течение 30 минут при встряхивании, как указано выше, в темноте при комнатной температуре.
   1. После этого инкубаторывозмущений мыть испытательной пластины и ресуспендируют бусины с 125 мкл буфера для анализа Wash и встряхните пластину для ~ две минуты, чтобы ресуспендируйте бисер перед помещением в анализе читателя.

11. Чтение тест плиты

1. Поместите тест-пластины в анализе читатель в течение 10 минут ресуспендированием бисера. В случае сбоя питания или других инцидентов, тест плиты можно хранить при комнатной температуре в темноте до 12 часов, пока не готова для чтения.
   1. Соблюдайте первого образца хорошо, чтобы убедиться, что выбранный шарик панели соответствует борта профиль в поисковых скважин. Если есть бисер, выходящие за «шарик регионе их назначенным на дисплее протокол, неправильный выбор профиля была сделана.
   2. Если бусины были должным образом ресуспендировали они должны заполнить свои указанного «регионы», указанные в программном обеспечении читателя анализом.
   3. Если бисер агрегируются они заполнят в своих регионах в медленномставки. Вы можете удалить испытательной пластины от читателя и вручную ресуспендируйте скважин. Растирают каждую лунку с многоканальной пипетки 3-4 раза, чтобы помочь при разгоне борта агрегатов. Заменить испытательной пластины в считывающее устройство и продолжить.

12. Представитель Результаты

1. Минимальное количество бусин читается в анализе и интенсивность флуоресценции фикоэритрин сообщается как о Медиана индекса флуоресценции (MFI) в диапазоне от 0 до 32667. После сравнения пунктам 25, 50 или 100 бусин на лунку мы не видели никаких статистических различий и регулярно рассчитывать 25 бусин на агента по образцу хорошо. Проверьте результаты отчета за ошибки, такие как недостаточная борта считает или не IgG / анти-IgG борта баллов. Эти шарики предназначены для «оценки» в рамках заранее определенного диапазона MFI, когда соответствующее количество первичных сыворотки и надписью реагенты добавляют в каждую лунку. Пример скважин с ошибками, (низкий борт счета) или не IgG управления борта оценки должныбыть повторен для приобретения достоверных результатов.
2. Экспорт результатов в листе Excel. Для нашей интерпретации данных каждого анализа присваивается:
   1. Ткань Control (TC) Тест: Для большинства анализов грызунов MFIA, ткани контроля экстракт дикого типа бакуловируса-инфицированных клетках насекомых.
   2. Анализ Cutoff: Это значение является минимальным флуоресценции ожидается и корректируется для каждого теста, чтобы максимизировать точность диагностики. Для большинства анализов, флуоресценция отсечки 3000.

3. Чистая Медиана индекса флуоресценции (MFI) рассчитывается для каждого анализа (за исключением тканей и IgG контрольных испытаний) по следующей формуле. Иными словами, конкретный сигнал анализа является общая анализа МФО минус TC (фон) MFI Это значение затем делится на 1000, который просто устанавливает диапазон Чистая МФО между 0-32 вместо 0-32,667.
   

   Чистая MFI = (MFI _{антител анализа} - MFI _{ткани управления)} / 1000

   Небраскат МФО и TC МФО преобразуются в баллы по сравнению с анализа Cutoff специфических для каждого антигена.

   

   
   Рисунок 2. Представитель MFIA данных для тестирования сывороток со всеми IgG контролирует прохождение.

4. 12,4 MFIA Интерпретация
   1. Результаты тестов плиты должны быть интерпретированы только если система-пригодность контроль и контроль сыворотки (IgG / анти-IgG бисер) результаты отвечают критериям приемлемости, перечисленным в таблице 2. Отказ от этих двух бусин IgG управления можно указать несколько процедурных ошибок, таких как неправильное или недостаточное разведение сопряженных объеме или SPE, неправильный тест разведении сыворотки или использование сыворотки от immunocomprimised животных.

      Таблица 2

      Критерии приемки для пробирного управления
      Управление	Приемлемого результата
      	Счет	Классификация
      Высокий уровень иммунной сыворотки	≥ 4,5	Положительный
      Низкий уровень иммунной сыворотки	≥ 1,5	≥ Пограничное
      Номера для иммунной сыворотки	<2,5	≤ Пограничное
      Разбавитель	<2,5	≤ Пограничное
      Ig бисера Комплект *	≥ Cutoff/1000	Проходить

      * Бисера установлен покрытый видоспецифические анти-тест сывороточных иммуноглобулинов (Ig): отсутствие оценки для данного элемента управления пригодности образца могут возникнуть в результате того недостаточных образца, слишком высокие разведения образца, неправильный вид или тестирование сыворотки от иммунодефицитными хоул.

   2. Если какой-либо из тестов управления плиты анализа неудачу, за исключением High Range иммунной сыворотки, результаты не являются приемлемыми и должны быть повторены. Переходя Низкий диапазон Сыворотка оценки управления имеют решающее значение, поскольку она демонстрирует уровень обнаружения чувствительность теста пластины.
   3. Коза анти-IgG видов борта оценка основана на количестве первичных сыворотки добавлен в анализе. Если это не удается управления шарик, но вид IgG проходит (ну B1, рис.3), то это означает, что достаточно реагентов тестирования (BAG, SPE) были добавлены к тесту хорошо, и это сыворотке связанный с этим вопрос. Если количество испытаний реагентов является недостаточным в частности хорошо и IgG и анти-IgG бисером управления не удастся (ну E1, рис.3).

      
      Рисунок 3. Представитель MFIA результатов теста с отказами (указано в оранжевый). Wells A1, C1, F1 указывают на ТС (ткань реактивной) недостаточностьгде оценка ТС представлен в скобках. Wells B1 и E1 иллюстрируют два типа IgG внутренние сбои управления, недостаточный тест на антитела (B1) или реагенты (E1) BAG / SPE соответственно.

   4. Если испытательная пластина результаты пробирного контроля являются удовлетворительными, индивидуальные показатели анализа классифицируются, как показано в таблице 3. Важно, чтобы подтвердить любые пограничные или положительное заключение по альтернативным методом испытания.

      Таблица 3

      MFIA Оценка классификация
      Счет			Классификация
      TC	Чистый	TC + Net *
      ≥ 2	<0,5	<2,5	Отрицательные (-)
      	≥ 0,5	≥ 2,5	Реакция TC (T)
      <2	<1,5		-
      	1,5 ≤ X <2,5		Пограничные (B)
      	≥ 2,5		Положительные (+)

      * Классификация отрицательное все еще может быть определена с ненулевым TC балл, полученный TC + Чистая рейтинг (оценка = Ag) отрицательно

Обсуждение

Процесс тестирования MFIA очень эффективно, требуется меньше оборудования и меньшие объемы реагента и образца, чем традиционные тесты singleplex. Функциональность мультиплекс система дает пользователю возможность экране одновременно для нескольких штаммов или серотипов общих агентов в лабораторных грызунов (например, коронавирус, парвовирусов и т.д.). Это также позволяет нам проектировать настроенных борта панели на основе области интересов (т.е. конкретной семьи вируса) и адаптируется к скрининга других типов биомолекул, в том числе цитокинов и других биомаркеров. Кроме того, она позволяет включать несколько внутренних тестов контроля для проверки образца и пригодности системы и тем самым обеспечить точность результатов. Они включают в себя управление ткани и IgG анти-тест сывороточных иммуноглобулинов видов (αIg) покрытием борта наборы для оценки пригодности образца. Ткани контроля борта обнаруживает неспецифического связывания сывороточного иммуноглобулина и контроля αIg шарик подтверждает, что сыворотка была добавлена ​​и содержит достаточной концентрации иммуноглобулина. Другой контроля шарик, покрытый сывороточных иммуноглобулинов видов, показывает, что меченые реагенты и анализа читатель функционируют должным образом. Другие коммерчески доступные мультиплекс формата серологические тесты (т.е. микрочипы, ИммуноКомб) не может предложить тот же уровень результатов подтверждения.

Возможность сузить круг возможных источников анализа отказа до повторного тестирования может помочь следователю сэкономить время и материалы. Критические аспекты MFIA должны быть подтверждены перед повторением неудачного образца. Так как анализ проводится при температуре окружающей среды следует убедиться в том, что лаборатория температура составляет около 27 ° C ± 2 ° C, более высокая температура может привести к снижению, чем ожидалось, показатели для контроля и образцов. Стиральные является, пожалуй, самым важным шагом в анализе. Страхование что тест пластины правильно мыть, уничтожил и ресуспендировали может устранитьПодавляющее большинство ошибок выборки в связи с низким количеством шарик (в связи с агрегированной бусины) или недостаточно того реагента (потеряли влагу из теста пластины фильтра внизу). Мы регулярно рассчитывать 25 бусин в анализе (агент) и не обнаружили статистической разницы в результатах, считая большее количество шариков, которые также могут привести к более длительному времени для чтения пластины.

Мы провели комплексные исследования проверки MFIA на несколько видов наиболее часто используемых лабораторных животных (мыши, крысы, хомяка, морской свинки и кролика), чтобы продемонстрировать диагностическую точность, воспроизводимость и надежность путем тестирования большого числа известных положительных и отрицательных образцах сыворотки и сравнивая их ELISA, IFA и MFIA результаты. Предел обнаружения (например, стандартные иммунной сыворотки концов титрование) из MFIA были сопоставимы, а в некоторых случаях превзошли те, соответствующего ELISA. Диагностическая специфичность, измеренная с SPF грызунов сыворотки, превысила 99%, общая betwee соответствияп ИФА и MFIA осуществляется на известные положительные и отрицательные сыворотки известные было больше, чем 95%. В целом, эти результаты доказали, что мультиплекс MFIA является хорошим заместителя singleplex ELISA, и пригоден для использования по назначению, т.е. в обычной серологического колоний лабораторных животных.