בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

Summary

בפרסום זה, אנו מתארים הליך מהיר ונוח לבידוד ותאי לבלב acinar העיקריים culturing מהלבלב העכברי. שיטה זו מהווה גישה רבת ערך כדי ללמוד את הפיסיולוגיה של תאי לבלב אקסוקרינית רגילים / untransformed העיקריים טריים.

Abstract

פרוטוקול זה מאפשר בידוד מהיר (בשעה פחות מ 1) לacini לבלב העכברי, כך שניתן לשמור אותם בתרבות ליותר משבוע אחד. ניתן לקבל יותר מ -20 10 ⁶ תאי acinar x מלבלב עכברי אחת. פרוטוקול זה מציע את האפשרות לעבד באופן עצמאי רבים כמו 10 לבלב במקביל. משום שהיא משמרת את ארכיטקטורת acinar, מודל זה מתאים גם ללימוד הפיסיולוגיה של הלבלב אקסוקרינית במבחנה בניגוד לשורות תאים הוקמו מגידולים בלבלב, המציגים שינויים גנטיים רבים וכתוצאה מכך האובדן חלקי או מוחלט של בידול acinar שלהם.

Introduction

בעיה נתקל לעתים קרובות למעבדות מחקר עובדים על רקמת לבלב אקסוקרינית היא הקושי בטיפוח תאים במבחנה acinar לתקופת הזמן ארוך מספיק כדי לאפשר ניסוי לטווח ארוך.

גורם אחד מונע פיתוח של מערכות תרבות כזו הוא הרגישות הפנימית של רקמת לבלב למניפולציה ניסויית בשל תכולה הגבוהה באנזימי glycolytic, פרוטאוליטי, וlipolytic, שפשוטו כמשמעו לעכל את רקמת הלבלב כאשר הם משתחררים בבידוד של תאי לבלב.

גורם שני הוא יוצא דופן בפלסטיות במבחנה של תאי acinar, אשר נוטים לאבד את התכונות שלהם והפרשת transdifferentiate לתאים בוגרים אחרים, כגון תאי לבלב או תאי ductal דמויי hepatocyte ^1. במבחנה, פלסטיות תא זה משתנה עם תנאי הניסוי (כמו הרכב בינוני תרבות) ² ומציג את מידת המורכבות לתוך העיצוב של תנאי התרבות מתאימים לתאי לבלב אקסוקרינית ^1.

כמה שיטות פותחו לבידוד ולתרבות של תאי acinar, ראשון מלבלב חזיר ים ^3-5. בתחילה, פרוטוקולים אלה מעורבים עיכול של רקמת לבלב עם collagenase, chymotrypsin, וקוקטייל פרוטאז, עם בידוד אולטימטיבי על ידי ניתוק מכאני נמרץ. תאי הלבלב שבודדו בדרך זו מוצגים מאפיינים מבניים ותפקודיים תקינים, בעיקר אובדן של מבני apical ונזק משמעותי לקולטניים הקרום שלהם. תאים מבודדים נותרו מעשיים עבור רק 1 או 2 ימים.

הכנת התפזרה acini שומר על אדריכלות הפנים ואינטר שלהם, שמירה על ממברנות תאים, הגבלת נזק לקולטנים על פני, ובכך לשפר את ההפרשה אקסוקרינית בתגובה לsecretagogues ^6-8. כresuLT, שיטה זו מציעה יתרון הגדול של הארכת כדאיות תא acinar ל7-10 ימים במבחנה. יתר על כן, בשיטה זו היא כיום העדיפה בידוד תא acinar ^9-12 בגלל התחזוקה של קשר אינטר, כולל תא צימוד על ידי צמתים פער, היא הקובע חיוני של פנוטיפ תא acinar הלבלב אקסוקרינית ^13.

כמו טשטוש ההבדלים של תאי acinar וtransdifferentiation לתאי ductal הוא אחד המנגנונים המוצעים לראשיתו של סרטן הלבלב אקסוקרינית אגרסיבי ^14, התפזר acini המודל הוא גם מערכת נאותה ללמוד פלסטיות לבלב והמנגנונים המולקולריים הבאים שלה. יתר על כן, בשילוב עם שימוש בבעלי חיים מהונדסים גנטי ^15,16 והפיתוח של טכניקות העברת גנים ⁽² adenoviral או התמרה lentiviral, שימוש של חלקיקים, וכו '), זה במודל תא acinar העיקרי מבחנה יכוללהיות מאוד שימושי בקביעת אופן תפקוד גנטי שונים משפיע על הוויסות של התמיינות תאי acinar או טשטוש הבדלים, ואמור לספק הבנה טובה יותר של האירועים המולקולריים האחראים להתפרצות של דלקת בלבלב, נגעים טרום סרטניים, ושינויים בפלסטיות תא.

בידוד של פזורים acini הוא הגישה שאנו משתמשים במעבדה שלנו לתאי לבלב acinar תרבות. אנחנו כאן לתאר ולדון בשיטה. זה כרוך בניתוק האנזימטית של רקמת לבלב (עם collagenase חיידקים) מצמידים את השיבוש מכאני ללא ניתוק של תאי acinar. בעוד שרוב הפרוטוקולים כרוכים culturing acini, או בהשעיה או במצעי פלסטיק שטופלו במיוחד, אנו לגדל אותם בהשעיה לזמן קצר בלבד (במשך 24 שעות), זריעתם אחר כך על גבי פיגומי מטריצה ​​אם נדרשת תרבית תאים ממושכת.

פרוטוקול זה מאפשר בידוד מהיר (בשעה פחות מ 1) התפזר לבלב ACINI, בר קיימא ליותר משבוע אחד בתרבות. זה מאפשר בידוד של יותר מ 20 x 10 ⁶ תאים לכל acinar לבלב עכבר. הפשטות שלו מאפשרת לעבד באופן עצמאי רבים כמו 10 לבלב במקביל. על ידי שמירה על אדריכלות הפנים ואינטר של acini ולכן הפנוטיפ acinar של תאים ראשוניים מבודדים, מודל זה מהווה מערכת של בחירה עבור המחקר של מנגנוני transdifferentiation, כמו כל דגמי הלבלב אקסוקרינית האחרים הזמינים כיום נגזרים מגידולים בלבלב מוצגות רבים גנטיים שינויים שהובילו להפיכה סלולרית.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת אתיקה תחת רגולציה של רשות שלטונית ("ד 'Comité הערכת Commun au מרכז לאון ראר, à l'Animalerie דה מעבר de l'ENS, au PBES et au Laboratoire P4" (CECCAPP)). עכברים נשמרו במתקן בעלי חיים ללא הפתוגן ספציפי ב" Plateforme AniCan, מרכז לאון ראר "(ליון, צרפת) וטפלו בעמידה בהנחיות מוסדיות.

ייצוג סכמטי של ההליך מוצג באיור 1.

1. Dissection הלבלב וDilaceration (יום 0)

נתיחה מהירה מאוד היא קריטית לתשואה אופטימלית של חילוץ ולבטח את כדאיות טובה של תאים בתרבית. על מנת לצמצם את הזמן דרוש לבידוד לבלב, כל המכשירים וציוד חייבים להיות מוכנים לפני המתת חסד העכבר.

1. להרדים את העכבר על ידי CO ₂ מחנק או נקע בצוואר רחם.

מהשלב הזה, כל הנהלים צריכים להתבצע תחת אווירה סטרילית (ארון בטיחות מיקרוביולוגית, רמה השנייה) עם ציוד נתיחת סטרילי.

2. תקן את העכבר ולרסס את בטן העכבר עם 70% אתנול. עם כל מספריים ומלקחיים לנתח, לעשות חתך בצורת V באזור איברי המין ולהמשיך אותו עד לסרעפת כדי לפתוח לחלוטין את חלל הבטן.
3. מקם את האונה של הכבד נגד הסרעפת, הם צריכים להישאר שם אם חלל הגוף פתוח מספיק רחוק. משוך את הבטן והמעי גס מחוץ לחלל הבטן לשמאלך, ולמצוא את הטבעת. עם זוג מלקחיים המעוקלים ולנתח מספריים, גזל וסעיף פי הטבעת.
4. עם אותו זוג מלקחיים, בזהירות לפרוש לחלוטין מהמעי פי הטבעת לקיבה על ידי משיכת המעי בצד שמאל.

> "אף אוזן גרון בשלב זה, את הלבלב ניתן להבחין בפס קטן בין הקיבה ותחילת המעי. Ligations עם הטחול יישאר ללא שינוי.

5. בעזרת מספריים נויס וזוג מלקחיים, לחתוך בזהירות את הלבלב לאורך המעי ולשחרר אותו עם טחול משאר מערכת העיכול.
6. תפוס את הטחול ולבלב הסעיף קשור אליו (איור 2).

בשלב זה, כדי להיות בטוח ששום רקמת mesenteric שומן ו / או רקמות סמוכות אחרות (טחול, מעי, וכו ') יכולים להיות שנאספו בלבלב, כדי למנוע זיהום סלולרי.

לשאר הליך, כל המאגרים חייבים להיות מוכנים ללא יון סידן Ca ^{2 +} chelators כדי למנוע ניתוק של רקמת הלבלב אקסוקרינית בתאים בודדים acinar המלא.

7. יש לשטוף את הלבלב פעמיים בתמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) 1x.

בשלב זה, כרקמת שומן תצוף בניגוד ללבלב שישקע, זה בקלות אפשר לדמיין ומהירות להסיר את רקמת השומן הלבנה המזהם עדיין מחוברת ללבלב.

אם הלבלב צריך להיות מועבר למתקן תרבית התאים, הוא חייב להיות כל הזמן על קרח בHBSS 1x.

8. העבר את הלבלב בצלחת פטרי סטרילית המכילה 5 מ"ל של HBSS 1x. בעזרת מספריים ואזמל נויס, פורס את הלבלב בחתיכות קטנות של 1 עד 3 מ"מ ³ (איור 3 א).

2. התכחשויות אנזימטיות ומכאניות של לבלב (יום 0)

1. להעביר אותם לתוך צינור סטרילי 50 מ"ל פוליפרופילן.
2. צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 450 XG ו 4 ° C. לשאוב וזורקים supernatant כדי להסיר שברי תאים ותאי דם.
3. הוסף 10 מ"ל של תמיסת IA collagenase (HBSS 1x המכיל 10 HEPES מ"מ, 200 U / מ"ל ​​של collagenase IA, ו0.25 מ"ג / מ"ל ​​של מעכב טריפסין) לסעיפים לבלב. בעזרת פיפטה סרולוגיות 25 מ"ל, להעביר אותם לבקבוק 25 ס"מ ^2. דגירה אותו במשך 20-30 דקות על 37 ° C. במהלך תקופה זו (כל 5 דקות), לבצע ניתוק מכאני על ידי אנרגטי נע קדימה ואחורה, שברי הלבלב כעשר פעמים, בpipettes סטריליים של גודל ירידה (25, 10, ו 5 pipettes סרולוגיות מ"ל).

בשלב זה, זה חיוני כדי לפקח על מידת הניתוק האנזימטית של סעיפי לבלב לעתים קרובות.

4. כשנראה שרקמת הלבלב להיות מנותק היטב (בהתאם להיעלמותו של ברים ללבלב והעכירות המוגברת של הפתרון) (איור 3), לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 10 מ"ל של תמיסה קרה שנאגרו כביסה (HBSS 1x המכיל 5 % סרום שור עוברי (FBS) ו10 HEPES מ"מ).
5. להעביר אותו לתוך צינור סטרילי 50 מ"ל פוליפרופילן וcentrifuge למשך 2 דקות ב 450 XG ו 4 ° C. בזהירות לשאוב וזורקים supernatant כדי להסיר את פתרון IA collagenase.
6. Resuspend ושטוף את הכדור עם 10 מ"ל של תמיסת שטיפה נאגרה. צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 450 XG ו 4 ° C. בזהירות לשאוב וזורקים supernatant. חזור על פעולה זו עוד פעמיים.

3. סינון וזריעה של מפוזר acini (יום 0)

1. Resuspend התא גלולה ב7 מ"ל של המדיום של Waymouth המכיל 2.5% FBS, 1% פניצילין, סטרפטומיצין תערובת (PS), 0.25 מ"ג / מ"ל ​​של מעכב טריפסין, ו25 ng / ml של רקומביננטי עוריות Growth Factor האנושי (EGF).
2. תסנין תערובת התא כך שהוא מאפשר לו לעבור ב100 מיקרומטר סינון כדי לשמר את שברים שאינם מתעכלים (צינורות, כלי דם, ואיים לנגרהנס). מבני acinar לבלב (acinus של 10-15 תאים) לעבור.
3. יש לשטוף את המסנן עם 6 מ"ל של FBS של Waymouth מדיום המכילים, PS, טריפסין INHibitor, וEGF.

לאחר שלב זה, התאים צריכים להיות מטופלים בזהירות רבה, כדי למנוע כל acini דיסוציאציה.

4. זרעי acini המבודד בצלחת תרבות 6 היטב (2 מ"ל לכל טוב) (איור 3 ג). תרבותם על 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% (V / V) אווירת CO _2.

לאחר שלב זה, התאים בתרבית acinar בהשעיה.

4. תרבית תאי acinar (יום 1 עד 10)

1. עשרים וארבע שעות אחרי, להעביר את acini (בהשעיה) לתוך צלחת תרבות 6 גם חדשה, כדי לחסל את התאים מזהמים ושאריות תאיות שיש דבק בין לילה (איור 4).

אם תרבית התאים צריכה להיות הוארכה במשך כמה ימים, או אם תנאי הניסוי דורשים תאים גדלו בmonolayer, מומלץ להעברה ולזרע acini על פיגומי מטריקס.

2. היום לפני לראותדינג על תמיכת מטריצה ​​(יום 0), מעיל צלחת תרבות 6 היטב עם סוג אני קולגן (5 מיקרוגרם / ² ס"מ). הוסף 1 מ"ל שלי פתרון קולגן סוג (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב0.02 חומצה אצטית M, 0.2 מיקרומטר סונן) היטב כל אחד ולאפשר לו לספוג באופן פסיבי פלסטיק, בשעה 1 ב 37 ° C (או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס ).
3. לשאוב את סוג פתרון קולגן אני ולשטוף היטב מצופה פעמיים עם פוספט שנאגר מלוח 1x.
4. לאפשר מצופה היטב לייבוש (מתחת לארון בטיחות מיקרוביולוגית) לפחות 12 שעות לפני השימוש.
5. העבר acini העיקרי המבודד (המתקבל בשלב 4.1) לסוגי צלחת קולגן מצופה 6 גם תרבות והתרבות באותם תנאים כפי שתואר קודם לכן (ב 37 מעלות מתחת ל -5% (V / V) אווירת C-CO ₂₎ . התאים לדבוק במצע קולגן אני הסוג למשך 2 ימים.
6. ביום 3, לשנות את התרבות בינונית לחסל תאים שאינם בנות קיימא שאינו דבקים. עם זמן בתרבות, התאים בהדרגה SPלקרוא על התמיכה המכילה קולגן. לשנות את התרבות בינונית כל 3 ימים (איור 5).

את התאים המתקבלים acinar המבודדים ניתן לספור, לאחר ניתוק מכאני מוחלט באמצעות תא ספירת תאי תומה. שימו לב שלא ניתן לשמור על תאי acinar מבודדים בתרבות אחר כך.

איכות תרבות acinar הושגה יכולה להיות נשלטה על ידי בדיקת הביטוי של סמני acinar ספציפיים כגון Trypsinogen, אלפא 1 גורם שעתוק לבלב המקטע, או A1 Carboxypeptidase (על ידי immunocytochemistry או ניסויי immunofluorescence).

תוצאות

איור 1 schematizes שיטת acini "התפזרה" לבידוד תאי acinar העיקרי. את השלבים הקריטיים, שבו יש לכבד בקפדנות במהלך הפרוטוקול, מתוארים בחלקו הדיון.

כדי להקל על הסרתו, יש לו את הלבלב שייגבה מהבטן יחד עם הטחול המצורף (איור 2). שנ...

Discussion

בפרוטוקול זה, אנו מתארים הליך לבידוד תאי acinar לבלב. שיטה זו מאפשרת לבודד יותר מ 20 x 10 ⁶ תאים לכל חיה acinar בשעה פחות מ 1. הודות ליישום המהיר ופשוט שלו (כמה שרק 10 לבלב יכול להיות מעובד באופן עצמאי לניסוי במקביל), פרוטוקול זה מופיע כפשרה טובה בין שיטות בידוד ^3-5,9-12,17 ק?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Dutscher	146560
10 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357551
100 μm filter	Beckton Dickinson	352360
100 mm Petri dish	Beckton Dickinson	353003
1000 μl filter tips	Starlab	S1122-1830
20 μl filter tips	Starlab	S1120-1810
200 μl filter tips	Starlab	S1120-8810
25 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357535
5 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357543
50 ml polypropylene tube	Beckton Dickinson	352070
6-well plate	Beckton Dickinson	353046
Acetic acid 100%	VWR BDH Prolabo	20104.298
Collagenase IA	Sigma-Aldrich	C2676
Curved forceps, Dumont #7	World Precision Instruments	14188	To sterilize before use
Dissecting scissors, straight	World Precision Instruments	14393	To sterilize before use
Epidermal Growth Factor, human	Promokine	C-60180
Ethanol absolute (AnalaR Normapur)	VWR BDH Prolabo	20821.310
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
Forceps, Dumont #5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Hank's Balanced Salt Solution 1x	Gibco	14025050
HEPES 1 M (pH 6.98-7.30)	Lonza	17-737F
Incubator O2/CO2	Sanyo	MCO-19M
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100
Matrigel	Beckton Dickinson	356234
Microbiological Safety Cabinet, level II	Faster	SafeFast Elite 212 S
Noyes scissors, sharp/sharp tips, German	World Precision Instruments	500228-G	To sterilize before use
Penicillin-Streptomycin mixture	Gibco	15140122
Phosphate Buffer Saline 10x	Gibco	14200067
Pipet-Aid	Drummond Scientific Company	Pipet-Aid XP
Pipetman P1000	Gilson	F123602
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P200	Gilson	F123601
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Scalpel	Paramount Surgimed Ltd.	Disposable Scalpel Size 23
T25 flask, 25 cm2	Sigma-Aldrich	Z707481
Trypsin inhibitor, from Glycine Max	Sigma-Aldrich	T6522
Type I collagen	Beckton Dickinson	354236
Waymouth's medium	Gibco	31220-023