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요약

이 문서에서는, 우리는 분리와 생쥐 췌장에서 배양 기본 췌장 포상 세포에 대한 신속하고 편리하게 절차를 설명합니다. 이 방법은 신선한 차 변환되지 않은 정상 / 외분비 췌장 세포의 생리학을 연구하는 귀중한 방법을 구성합니다.

초록

이 프로토콜은 가능한 일주일 이상 그들의 문화를 유지하고, 생쥐 췌장 acini의 신속한 분리 (이하 HR)에서 허용합니다. 20 개 이상 X 10 6 포상 세포는 하나의 쥐 췌장에서 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 독립적으로 병렬로 많은 10 췌장을 처리 할 수​​있는 가능성을 제공합니다. 이 포상 구조를 유지하고 있기 때문에,이 모델은 잘 그들의 포상 분화의 일부 또는 전체 손실의 결과 많은 유전 변경을 표시 췌장 종양에서 설립 세포 라인과는 달리 체외에서 외분비 췌장의 생리를 공부에 적합합니다.

서문

외분비 췌장 조직 작업 연구 실험실 자주 발생하는 문제는 충분히 장기적인 실험을 할 수 있도록 일정 기간 동안 체외에서 포상 세포를 배양의 어려움이다.

이러한 문화 시스템의 개발을 방해 한 요인들은 췌장 세포의 분리 중에 출시 할 때 그대로 췌장 조직을 소화, 당분 단백질 분해하고 지방 분해 효소의 높은 콘텐츠로 인해 실험 조작에 췌장 조직의 고유 감도이다.

두 번째 인자가 분비 특성을 잃게하고 췌관 세포 나 간세포와 같은 세포 1. 등의 성숙한 세포로 transdifferentiate하는 경향이 포상 세포의 체외 소성의 놀라운 체외에서이 세포의 가소성은 실험 조건에 따라 달라집니다 (예 : 배지 조성 등 2) 를 한모금 및 외분비 췌장 세포 1에 적합한 배양 조건의 디자인에 복잡성의 정도를 소개합니다.

여러 가지 방법이 처음 기니 돼지 췌장 3-5에서 포상 세포의 분리 및 배양을 위해 개발되었습니다. 처음에는 이러한 프로토콜은 활발한 기계적 분리에 의해 궁극적 격리와 콜라, 키모 트립신, 그리고 단백질 분해 효소 칵테일과 췌장 조직의 소화를하고있었습니다. 이런 식으로 고립 된 췌장 세포는 특히 비정상적인 구조 및 기능적 특성, 정점 구조와 자신의 막 수용체에 중요한 손상의 손실을 표시됩니다. 고립 된 세포는 1 개 또는 2 일 동안 가능한 남아 있었다.

의 준비 acini이 분비 6-8에 대한 응답으로 표면의 수용체에 손상을 제한하기 때문에 외분비 분비를 개선, 세포의 세포막을 유지, 자신의 내부 및 간 아키텍처를 유지하고 분산. 열매로그건,이 방법은 체외에서 7-10까지 일 포상 세포 생존 능력을 확장하는 중요한 이점을 제공합니다. 갭 접합에 의한 세포 커플 링 등 간 연락처, 유지 보수는 외분비 췌장 포상 세포의 표현형 13의 중요한 결정이기 때문에 또한,이 방법은 현재 9-12 포상 세포 분리하는 것이 바람직하다.

포상 세포와 유관 세포들이 분화의 탈분화 공격적인 외분비 췌장 암 (14)의 기원에 대해 제안 된 메커니즘 중 하나이기 때문에, 분산 acini 모델은 또한 췌장의 가소성과 그 이후의 분자 메커니즘을 연구하는 적절한 시스템입니다. 또한, 유전자 변형 동물 15,16의 사용과 유전자 전달 기술의 개발 (아데노 바이러스 2 렌티 바이러스 전달, 나노 입자 등의 사용)와 함께이 체외 기본 포상 세포 모델 수다양한 유전 적 장애는 포상 세포 분화 또는 탈분화의 규정에 영향을 미칠 췌장염의 발병, 전암 병변 세포 가소성의 변화에​​ 대한 책임 분자 사건의 더 나은 이해를 제공하는 방법을 결정하는 데 매우 유용합니다.

분산 acini의 분리는 우리가 문화 췌장 포상 세포 연구실에서 사용하는 방법입니다. 우리는 여기에서 설명하고 사용 방법을 설명합니다. 그것은 포상 세포의 분리없이 기계적 중단에 결합 된 췌장 조직 (박테리아 콜라 포함)의 효소 해리을 포함한다. 대부분의 프로토콜이 정지 또는 특수 처리 플라스틱 기판에 하나 배양 acini를 포함하는 동안, 우리는 장기 세포 배양이 필요한 경우 매트릭스 비계에 나중에 그들을 뿌리기 만 간단히 (24 시간)을 정학을 성장.

이 프로토콜은 분산 췌장 교류의 신속한 분리 (이하 HR)에서 할 수 있습니다INI, 문화에 1 주일 이상 지속. 그것은 마우스의 췌장 당 20 × 10 6 포상 세포의 분리 할 수 있습니다. 단순는 가능한 독립적으로 병렬로 많은 10 췌장을 처리 할 수​​ 있습니다. 현재 사용할 수있는 모든 다른 외분비 췌장 모델은 많은 유전 적 표시 췌장 종양에서 파생 된대로 acini의 내부 및 간 아키텍처와 이렇게 고립 된 일차 전지의 포상 표현형을 유지하여,이 모델은, 분화 메커니즘 연구를위한 선택의 시스템을 구성 변화는 세포의 변화를 선도.

프로토콜

모든 절차는 정부 기관의 규정에 따라 윤리위원회의 승인 ( "위원회 (CCT) D' 평가 한국 통신 프 센터 레온 베라, à L' Animalerie 드 운송 드 난 ENS, AU PBES 등 누구나 LABORATOIRE P4"(CECCAPP)).되었다 마우스는 "Plateforme AniCan, 센터 레온 베라"(리옹, 프랑스)에서 특정 병원균이없는 동물 시설의 유지 관리 및 제도적 지침에 처리 하였다.

절차의 개략도는 그림 1에 표시됩니다.

1. 췌장의 해부 및 Dilaceration (0 일)

매우 빠른 해부 추출의 최적의 수율 중요하며, 문화에 세포의 좋은 가능성을 확보 할 수 있습니다. 췌장 분리에 필요한 시간을 줄이기 위해 모든 악기 및 장비는 마우스를 안락사 전에 준비해야합니다.

  1. CO 2 질식 또는 자궁 경부 전위 마우스를 안락사.

이 단계에서 모든 절차는 무균 해부 장비와 멸균 분위기 (미생물 학적 안전 캐비닛, 레벨 II)에서 수행해야합니다.

  1. 마우스를 고정하고 70 % 에탄올로 마우스 복부를 스프레이. 모든 해부 가위와 집게, 성기 영역에서 V 자형 절개를 완전히 복강을 열고 다이아 프램에 그것을 계속합니다.
  2. 다이아 프램에 간 엽 (叶)의 위치, 몸의 구멍은 충분히 열려 있으면 그들은 남아 있어야합니다. 왼쪽으로 복강 외부 창자와 콜론을 당겨 직장을 찾을 수 있습니다. 곡선 포셉 및 해부 가위, 알고 섹션 직장을의 쌍.
  3. 포셉의 동일한 쌍을주의 깊게 왼쪽에 소장을 잡아 당겨 배에 직장에서 완전히 장을 풀다.
이 단계에서 ENT ">, 췌장은 위장과 창자의 시작 사이에 작은 지구로 구분할 수 있습니다. 비장과 그것의 ligations이 그대로 유지됩니다.

  1. 주의 창자를 따라 췌장을 절감하고 소화관의 나머지 비장으로 해방, Noyes 가위와 집게의 쌍을 사용.
  2. 비장과 절합니다 (그림 2)에 연결된 췌장을 잡아.

이 단계에서, 더 장간막 지방 조직 및 / 또는 기타 주변 조직이 (비장, 대장 등) 세포의 오염을 방지하기 위해, 췌장 수집하지 할 수 있는지 확인하십시오.

프로 시저의 나머지 모든 버퍼는 단일 포상 세포 외분비 췌장 조직의 완전한 분리를 방지하기 위해 칼슘 이온 칼슘 2 + 킬레이트없이 준비해야합니다.

  1. 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1X 두 번 췌장을 씻어.

이 단계에서, 같은 지방 조직이 가라 앉을 것 췌장 반대로, 그것은 여전히​​ 췌장에 부착 된 오염 물질의 흰색 지방 조직을 시각화하고 빠르게 제거하는 간단하게 뜰 것이다.

췌장 세포 배양 시설로 이송해야하는 경우, 그것은 HBSS 1X에서 얼음에 보관해야합니다.

  1. HBSS 1X의 5 ML을 포함하는 멸균 페트리 접시에있는 췌장을 전송합니다. Noyes 가위와 메스를 사용하여, 1-3mm 3 (그림 3A)의 작은 조각의 췌장을 슬라이스.

2. 췌장 효소 및 기계 Dissociations (0 일)

  1. 멸균 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 그들을 전송합니다.
  2. 450 XG 4에서 2 분 동안 원심 분리기 ° C. 기음과 세포 조각과 혈액 세포를 제거하는 상층 액을 버린다.
  3. 콜라게나 IA 솔루션의 10 ML (HBSS 1X 10 MM의 HEPES, collagena 200 U / mL를 함유 추가췌장 섹션 SE IA, 0.25 ㎎ / 트립신 억제제 ML). 25 ML 혈청 피펫 사용, 25cm 2 플라스크에 전송할 수 있습니다. 37 ~ 30 분 정도 품어 ° C. 이 시간 (매 5 분) 동안 감소 크기의 멸균 피펫 (25, 10, 5 ML 혈청 피펫)에서 정력적으로 열 번 정도 앞뒤로 췌장 조각을 이동하여 기계적 분리를 수행합니다.

이 단계에서, 그것은 자주 췌장 섹션의 효소 분리의 정도를 모니터링하는 것이 필수적입니다.

  1. 췌장 조직이 잘 해리 것으로 보이는 경우 (췌장 조각의 실종과 솔루션의 증가 탁도에 따라) (그림 3B), 감기의 10 ML을 추가하여 효소 반응을 정지 (HBSS 1X 5를 포함하는 세척 완충 용액 % 태아 소 혈청 (FBS), 10 MM의 HEPES).
  2. 멸균 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브와 CENTR에 그것을 전송450 XG에 2 분, 4 ° C.에 대한 ifuge 조심스럽게 기음과 콜라게나 IA 솔루션을 제거하는 상층 액을 버린다.
  3. resuspend을 버퍼에 세척 용액 10ml로 펠렛을 씻으십시오. 450 XG 4에서 3 분 동안 원심 분리기 ° C. 조심스럽게 기음과 상층 액을 버린다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.

3. 여과 및 시드 것은 (0 일) Acini을 분산

  1. 2.5 % FBS가 포함 된 Waymouth의 매체 7 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 혼합 (PS), 0.25 ㎎ / 트립신 억제제, 25 NG / 재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF)의 ML의 ML.
  2. 그것은 비 소화 조각을 (덕트, 혈관, 및 랑게르한스 섬) 유지 필터를 100 μm의를 통과함으로써 여과 세포 혼합물. 췌장 포상 구조 (10 ~ 15 세포의 acinus)를 통해 전달합니다.
  3. Waymouth의 매체를 포함하는 FBS, PS, 트립신 INH 6 ml의 필터를 씻어ibitor 및 EGF.

이 단계 후에, 세포는 acini 분리를 방지하기 위해 매우 신중하게 처리해야합니다.

  1. 씨앗 6 - 잘 배양 접시에서 분리 된 acini (물론 당 2 ㎖) (그림 3C). ° C % 5에서 (v / v)의 CO 2 분위기 37 문화를.

이 단계 후에, 포상 세포 현탁액 배양한다.

4. 포상 세포 배양 (일 1 ~ 10)

  1. 스물 네 시간 후에, 오염 물질의 세포 (그림 4) 야간 부착 한 세포 잔해를 제거하기 위해, 새로운 6 - 잘 배양 접시에 (서스펜션) acini를 전송합니다.

세포 배양은 몇 일 또는 실험 조건 세포가 단층으로 성장이 필요한 경우, 그것은 매트릭스 비계에 전송 및 씨앗 acini에 추천 확장해야하는 경우.

  1. 참조 전날매트릭스 지원에 땡 (0 일), 코트 유형 6 - 잘 배양 접시 콜라겐 (5 ㎍ / cm 2). (0.02 M 초산 50 ㎍ / ㎖, 0.2 μm의 필터링) 각 well에 I 형 콜라겐 용액 1 ㎖를 추가하고 37 ° C (또는 하룻​​밤에에서 1 시간 동안 소성에가에 수동적으로 흡착 할 수 ° C ).
  2. 타입 I 콜라겐 솔루션을 기음과 인산염 식염수 1X 잘 두 번 코팅을 씻어.
  3. 사용하기 전에 (미생물 안전 캐비닛 아래에) 최소한 12 시간 건조에 잘 코팅 할 수 있습니다.
  4. 형 앞에서 설명한 것과 같은 조건에서 콜라겐 코팅 6 - 잘 문화 요리와 문화 그 (37 ° C % 5에서 (v / v)의 CO 2 분위기)에 고립 된 차 acini를 (단계 4.1에서 얻은)로 이동 . 세포 2 일 유형 I 콜라겐 기질을 준수합니다.
  5. 3 일에 준수하지 않는 가능한 세포를 제거하기 위해 문화 매체를 변경합니다. 문화 시간에 세포가 점진적으로 SP됩니다콜라겐 함유 지원을 참조하십시오. 배양액을 3 일마다 (그림 5)을 변경합니다.

얻은 격리 포상 세포 토마 셀 계산 챔버를 사용하여 완전한 기계적 분리 한 후 계산 할 수 있습니다. 고립 포상 세포는 나중에 문화에 유지 될 수 없습니다.

얻은 포상 문화의 품질 등 시노, 췌장 전사 인자 1 소단위 알파, 또는 carboxypeptidase가의 A1 (면역 세포 나 면역 실험에 의해) 등의 포상 특정 마커의 발현을 확인하여 제어 할 수 있습니다.

결과

그림 1은 기본 포상 세포 분리에 대해 "분산"acini 방법을 schematizes. 엄격 프로토콜 중에 존중해야 할 중요한 단계는, 토론 부분에 설명되어 있습니다.

의 제거를 용이하게하기 위해 췌장은 첨부 된 비장 (그림 2)와 함께 복부에서 수집 할 수 있습니다. 두 기관은 떨어져 절단해야하고, 여전히 췌장에 부착 할 수있는 잔여 지방 조직은 (단계 1.6)를 ...

토론

이 프로토콜에서는, 우리는 췌장 포상 세포를 분리하기위한 절차를 설명합니다. 이 방법은보다 1 시간에 동물 당 20 × 10 6 포상 세포를 분리 할 수 있습니다. 의 신속하고 간단한 구현 (많은 10 췌장은 독립적으로 병렬 실험 당 처리 할 수 있습니다) 덕분에,이 프로토콜은 기존의 분리 방법 3-5,9-12,17 사이 좋은 타협으로 나타납니다.

중요한 단계 / 트러블 슈팅...

공개

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 말

우리는 동물 보호와의 기술 지원을 AniCan의 직원 (CRCL, 리옹) 감사합니다. 이 작품은 협회 부어 라 공들인 쉬르 르 암으로, 문화원 국립 뒤 암에 의해, 그리고에서 장학금으로 문화원 국립 드 라 상테 엣 드 라 공들인 Médicale (INSERM Avenir에서 프로그램), 리그 국립 Contre 르 암에 의해 지원되었다 프랑스 Ministère 드 난 Enseignement 수피 리어 엣 드 라 공들인에서 문화원 국립 뒤 암 (JG), (RMP와 DFV)에서와 협회 부어 라 공들인 쉬르 르 암에서 리그 국립 Contre 르 암 (JG), ( DFV).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Reagent/MaterialCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm filterDutscher146560
10 ml serological pipettesBeckton Dickinson357551
100 μm filterBeckton Dickinson352360
100 mm Petri dishBeckton Dickinson353003
1000 μl filter tipsStarlabS1122-1830
20 μl filter tipsStarlabS1120-1810
200 μl filter tipsStarlabS1120-8810
25 ml serological pipettesBeckton Dickinson357535
5 ml serological pipettesBeckton Dickinson357543
50 ml polypropylene tubeBeckton Dickinson352070
6-well plateBeckton Dickinson353046
Acetic acid 100%VWR BDH Prolabo20104.298
Collagenase IASigma-AldrichC2676
Curved forceps, Dumont #7World Precision Instruments14188To sterilize before use
Dissecting scissors, straightWorld Precision Instruments14393To sterilize before use
Epidermal Growth Factor, humanPromokineC-60180
Ethanol absolute (AnalaR Normapur)VWR BDH Prolabo20821.310
Fetal Bovine SerumLonza14-801F
Forceps, Dumont #5World Precision Instruments14098To sterilize before use
Hank's Balanced Salt Solution 1x Gibco14025050
HEPES 1 M (pH 6.98-7.30)Lonza17-737F
Incubator O2/CO2SanyoMCO-19M
Inverted microscopeNikonEclipse TS100
MatrigelBeckton Dickinson356234
Microbiological Safety Cabinet, level IIFasterSafeFast Elite 212 S
Noyes scissors, sharp/sharp tips, GermanWorld Precision Instruments500228-GTo sterilize before use
Penicillin-Streptomycin mixtureGibco15140122
Phosphate Buffer Saline 10x Gibco14200067
Pipet-AidDrummond Scientific CompanyPipet-Aid XP
Pipetman P1000GilsonF123602
Pipetman P20GilsonF123600
Pipetman P200GilsonF123601
Refrigerated centrifugeEppendorf5810R
ScalpelParamount Surgimed Ltd.Disposable Scalpel Size 23
T25 flask, 25 cm2Sigma-AldrichZ707481
Trypsin inhibitor, from Glycine MaxSigma-AldrichT6522
Type I collagenBeckton Dickinson354236
Waymouth's mediumGibco31220-023

참고문헌

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