Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Özet

Bu yayında, böylece yalıtma ve sıçangil pankreas kültür birincil pankreatik acinar hücreleri için bir hızlı ve uygun bir prosedürü açıklar. Bu yöntem taze birincil dönüştürülmemiş / Normal ekzokrin pankreas hücrelerinin fizyolojisi incelemek için değerli bir yaklaşım oluşturmaktadır.

Özet

Bu protokol, bu birden fazla olası hafta bunların kültür korumak için yapmak, kemirgen pankreas asinüs hızlı izolasyonu (en az 1 saat olarak) izin verir. En az 20 x 10 ⁶ asiner hücrelerin, tek bir sıçangil pankreasından elde edilebilir. Bu protokol bağımsız paralel 10 gibi pankreaslarında işlemek için imkan sunuyor. Bu asiner mimarisi korur, çünkü bu model de kendi asiner farklılaşma kısmen veya tamamen kaybı ile sonuçlanan birçok genetik değişiklikler görüntülemek pankreas tümörleri, gelen kurulan hücre hatları aksine in vitro pankreas fizyolojisi eğitim için uygundur.

Giriş

Ekzokrin pankreas dokusu üzerinde çalışan araştırma laboratuvarları için sık karşılaşılan sorun yeterince uzun uzun vadeli bir deneme sağlamak için bir süre için in vitro asiner hücrelerin yetiştirilmesi zorluğudur.

Bu tür kültür sistemlerinin geliştirilmesi engelleyen bir faktör de pankreas hücrelerinin izolasyonu sırasında serbest zaman tam anlamıyla pankreas doku sindirmek, glikolitik proteolitik ve lipolitik enzimler, en yüksek içeriği nedeniyle deneysel manipülasyon için pankreas dokusunun içsel duyarlılığı.

İkinci bir faktör, salgı özelliklerini yitirmesine ve bu pankreatik duktal hücreleri veya hepatosit benzeri hücreler ^1. Gibi diğer olgun hücrelerin, için transdifferentiate eğilimi asiner hücreler, in vitro plastisitede dikkat çekicidir in vitro olarak, bu hücre plastisite deneysel koşullar ile değişir (örneğin, kültür ortamının bileşimi gibi) ² destek ve ekzokrin pankreas hücreleri ¹ için uygun kültür şartları ile içine karmaşıklığı bir ölçüde tanıttı.

Birçok yöntem ilk kobay pankreas asinar ^3-5, hücrelerin izolasyonu ve kültürü için geliştirilmiştir. Başlangıçta, bu protokoller güçlü mekanik ayrışma ile nihai yalıtımlı, kollajenaz, kimotripsin ve bir proteaz kokteyl ile pankreas doku sindirim çıkıyor. Bu şekilde izole edilmiş pankreas hücreleri, özellikle anormal yapısal ve işlevsel özellikleri, apikal yapıları ve membran reseptörlerine önemli hasar bir kayıp gösterdi. İzole hücreler sadece 1 ya da 2 gün boyunca yaşayabilecek durumda kalır.

Hazırlanması asinüs salgı ^6-8 cevaben yüzeyi reseptörlerine hasar görmesini sınırlayarak, ve böylece ekzokrin salgılanması iyileştirilmesi, hücre zarı koruyarak, bunların hücre içi ve arası mimari korur dağıldı. Bir resu olarakLT, bu yöntem, in vitro olarak 7-10 gün asinar hücre canlılığı uzanan en önemli avantaj sağlar. Gap junction ile hücre bağlantısı da dahil olmak üzere hücreler arası iletişim, bakımı ekzokrin pankreas asiner hücre fenotip ¹³ önemli bir belirleyicisi olduğu için Ayrıca, bu yöntem şu anda ^9-12 asiner hücre izolasyonu için tercih edilir.

Asiner hücreler ve duktal hücrelerine kendi transdiferansiasyon en dediferansiyonunu agresif ekzokrin pankreas kanserleri ¹⁴ doğuşu için önerilen mekanizmalardan biri olduğu için, dağınık acini modeli aynı zamanda pankreas plastisite ve sonraki moleküler mekanizmaları incelemek için yeterli bir sistemdir. Ayrıca, genetik olarak değiştirilmiş hayvanların ^15,16 kullanımı ve gen transfer tekniklerinin geliştirilmesi (adenoviral ² veya lentiviral transdüksiyon, nanopartiküller, vb kullanımı), ile birlikte bu vitro birincil asiner hücre modelinde yapabilirsinizçeşitli genetik bozukluklar asiner hücre farklılaşması veya dediferansiyonunu düzenlenmesi etkiler ve pankreatit başlangıcı, prekanseröz lezyonlar, ve hücre plastisite değişiklikler sorumlu moleküler olayların daha iyi anlaşılmasını sağlamak nasıl belirlemede çok yararlı olabilir.

Dağınık acini izolasyonu biz kültür pankreas asiner hücrelere Laboratuvarımızda kullandığımız yaklaşımdır. Biz burada açıklamak ve kullanılan yöntemi tartışmak. Bu asiner hücre ayrışma olmadan mekanik bozulmasına birleştiğinde pankreas doku (bir bakteri kollajenazlarla) enzimatik ayrışma içerir. En protokoller süspansiyon veya özel işleme tabi tutulan plastik yüzeylerde ya kültür acini, dahil ederken, uzun süreli hücre kültürü gerekli ise matris iskeleleri üzerine sonradan tohumlama, sadece kısa bir süre (24 saat) süspansiyon bunları büyür.

Bu protokol dağınık pankreas ac hızlı izolasyonu (az 1 saat içinde) sağlarini, kültür birden fazla hafta sürdürülebilir. Bu fare pankreası başına en fazla 20 x 10 ⁶ asiner hücrelerin izolasyonu sağlar. Sadeliği mümkün bağımsız paralel olarak 10 gibi pankreaslarında işlemek için yapar. Mevcut diğer tüm ekzokrin pankreas modelleri birçok genetik gösteren pankreas tümörleri türetilen gibi asini içi ve hücreler arası mimari ve böylece izole primer hücrelerin asiner fenotip koruyarak, bu model, transdiferansiasyon mekanizmalarının çalışma için tercih edilen bir sistem oluşturur Değişiklik hücresel dönüşüme yol açar.

Protokol

Tüm işlemler kamu otoriteleri düzenleyici altında bir etik kurul tarafından onaylanmış ("Comité d'Değerlendirme Haberleşme au Merkezi Léon Bérard, à l'ANIMALERIE de geçiş de l'ENS, au PBES et au laboratuarı P4" (CECCAPP)). Edildi Fareler "PLATEFORME AniCan, Merkezi Léon Bérard" (Lyon, Fransa) bir spesifik patojen free hayvan tesis muhafaza ve kurumsal düzenlemeler uygun olarak ele alınmıştır.

Prosedürünün bir şematik gösterimi Şekil 1 'de gösterilmiştir.

1. Pankreas Diseksiyon ve Dilaceration (Gün 0)

Bir çok hızlı bir diseksiyon ekstraksiyon optimal verim için önemlidir ve kültür içinde hücreleri iyi bir canlılığı sağlamak için. Pankreas izolasyonu için gereken zamanı azaltmak için, tüm alet ve ekipmanlar fare ötenazi önce hazır olmalıdır.

1. CO ₂ boğulma veya servikal dislokasyon ile fare Euthanize.

Bu adım, tüm işlemler steril diseksiyon ekipmanları ile steril bir ortamda (mikrobiyolojik güvenlik kabini, seviye II) altında yapılması gerekir.

2. Fare düzeltmek ve% 70 etanol ile fare karın sprey. Herhangi bir diseksiyon makas ve forseps ile, genital bölgede bir V şeklinde kesi yapmak ve tamamen karın boşluğuna açmak için diyafram o kadar devam ediyor.
3. Diyafram karşı karaciğer lobları yerleştirin; vücut boşluğuna yeterince açık ise orada kalmalıdır. Sol için karın boşluğu dışında bağırsak ve kolon çekin ve rektum bulmak. Kavisli bir forseps ve diseksiyon makas, kapmak ve bölüm rektum bir çift.
4. Forseps aynı çifti ile, dikkatli bir şekilde sol tarafta bağırsak çekerek mide rektum tamamen bağırsak göz önüne sermek.

Bu aşamada ent ">, pankreas, mide ve bağırsak başlangıcı arasında ince bir şerit olarak ayırt edilebilir. dalak ile onun ligasyonu sağlam kalır.

5. Dikkatle bağırsak boyunca pankreas kesme ve sindirim sistemi geri kalanından dalak ile kurtarmak, Noyes makas ve forseps bir çift kullanarak.
6. Dalak ve bu bölümü (Şekil 2) bağlı olan pankreas al.

Bu aşamada, hiçbir mezenterik yağ dokusu ve / veya diğer komşu doku (dalak, bağırsak, vb) hücresel kirlenmesini önlemek için, pankreas ile toplanmış olabilir emin olun.

Prosedürün geri kalanı için, her bir tampon acinar hücreleri içinde, ekzokrin pankreas dokusunun tam ayrılma önlemek için kalsiyum iyonu kenetleyiciler ^{Ca2 +} olmadan hazırlanmış olmalıdır.

7. Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde iki kez 1x pankreas durulayın.

Bu adımda, gibi yağ dokusu batar pankreas aykırı, hala pankreas bağlı kirletici beyaz yağ dokusu görselleştirmek ve hızlı bir şekilde kaldırmak için kolayca mümkündür yüzer.

Pankreas hücre kültürü tesisine taşınması gerekiyorsa, bu HBSS 1x buz üzerinde tutulmalıdır.

8. HBSS 1x 5 ml içeren steril Petri kabındaki pankreas aktarın. Noyes makas ve bir neşter kullanılarak, 1-3 mm ³ (Şekil 3A), küçük parçalar halinde pankreas dilim.

2. Pankreas enzimatik ve mekanik ayrışmalar (Gün 0)

1. , Steril bir 50 ml polipropilen tüpe aktarın.
2. 450 x g ve 4 de 2 dakika süre ile santrifüje ° C Aspire ve hücre parçaları ve kan hücreleri çıkarmak için supernatant atın.
3. Kollajenaz IA 10 ml çözelti (HBSS 1x 10 mM HEPES collagena 200 U / ml ihtiva eden eklemepankreas bölümleri SE, IA ve 0.25 mg / ml tripsin inhibitörü). 25 ml serolojik pipet kullanarak, bir 25 cm ² balon aktarabilirsiniz. 37 20-30 dakika için inkübe ° C Bu süre (her 5 dk) sırasında, azalan büyüklükte steril pipetler (25, 10, ve 5 ml serolojik pipet) içinde, enerjik on kere geri ve ileri-pankreas parçaları hareket ettirerek mekanik bir ayrışma gerçekleştirin.

Bu aşamada, bu sık sık pankreas bölümlerinin enzimatik ayrılma derecesini izlemek için gereklidir.

4. Pankreatik doku de-ayrışmış gibi durduğu zaman (pankreas parçalarının ortadan kalkması ve solüsyonun yüksek bulanıklık göre) (Şekil 3B), soğuk 10 ml eklenerek enzimatik reaksiyonu durdurmak (HBSS 1x 5 ihtiva eden yıkama çözeltisi tamponlu % fetal sığır serumu (FBS) ve 10 mM HEPES).
5. , Steril bir 50 ml polipropilen boru ve centr içine aktarın450 x g'de 2 dakika ve 4 ° C ve ifuge Dikkatlice aspire ve kollajenaz IA çözüm kaldırmak için süpernatant atın.
6. Yeniden süspanse edin ve tamponlu yıkama solüsyonu 10 ml ile pelet yıkayın. 450 x g ve 4 3 dakika boyunca santrifüj ° C Dikkatlice aspire ve supernatant atın. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın.

3. Filtrasyon ve tohumlama (Gün 0) acini Dağınık

1. % 2.5 FBS içeren Waymouth orta 7 ml hücre pelletini,% 1 Penisilin-Streptomisin karışımı (PS), 0.25 mg / tripsin inhibitörü, ve 25 ng / yeniden birleştirici insan epidermal büyüme faktörü (EGF) ml ml.
2. Bu non-sindirilmiş parçaların (kanalları, kan damarları ve Langerhans adacıkları) korumak için bir filtre 100 mikron geçmesine izin süzüntü hücre karışımı. Pankreas asiner yapılar (10-15 hücre acinus) geçer.
3. Waymouth orta FBS ihtiva eden, PS, tripsin inh 6 mL 'si ile yıkayınız filtreibitor, ve EGF.

Bu aşamadan sonra, hücreler, herhangi bir asinüs ayrışma önlemek için, çok dikkatli bir şekilde tedavi edilmesi gerekir.

4. Tohum, 6-çukurlu kültür kaplarına izole asinüs (oyuk başına 2 ml) (Şekil 3C). ° C altında% 5 (v / v) _CO2 atmosfer 37 Kültür bunları.

Bu aşamadan sonra, asiner hücreler süspansiyonda kültürlendi.

4. Asiner Hücre Kültürü (Gün 1 ile 10)

1. Yirmi dört saat sonra, kirletici hücreleri ve (Şekil 4) gece yapıştırılır var hücresel kalıntıları ortadan kaldırmak için, yeni bir 6-iyi bir kültür çanak içine (süspansiyon) acini aktarın.

Hücre kültürü birkaç gün ya da deneysel koşullar hücreleri tek tabaka yetiştirilen gerektiriyorsa, bu matris iskele üzerinde transferi ve tohum acini tavsiye edilir uzatılabilir gerekiyorsa.

2. Görmeden günmatris destek ding (Gün 0), ceket tipi bir 6-iyi bir kültür çanak I kollajen (5 mg / cm ^2). (0.02 M asetik asit içinde 50 ug / ml, 0.2 mikron filtre) her kuyuya tip I kolajen çözeltisi 1 ml ilave edilir ve 37 ° C'de (ya da gece boyunca 4 de, 1 saat boyunca, plastik üzerinde pasif olarak adsorbe izin ° C .)
3. Tip I kolajen çözeltisi aspire edin ve fosfat-tamponlu tuzlu su ile 1x iki kat daha iyi kaplanmış yıkayın.
4. Kullanmadan önce (bir mikrobiyolojik güvenlik kabini altında) en az 12 saat kuruması için de kaplı izin verin.
5. Türü daha önce tarif edilenle aynı koşullarda I kollajen kaplı 6 oyuklu kültür çanağı ve bunların kültür (37 ° C de% 5 altında (v / v) _CO2 atmosferi) içine izole edilmiş primer asinüs (Basamak 4.1 'de elde edilmiş) transferi . Hücreler, 2 gün boyunca, tip I kollajen alt tabakaya yapışır.
6. Gün 3, uymadığımızı cansız hücreleri ortadan kaldırmak için kültür ortamı değiştirin. Kültür Zamanla, hücreleri giderek sp olacakkollajen ihtiva eden destek üzerinde okuyun. Kültür ortamı her 3 günde bir (Şekil 5) değiştirin.

Elde edilen izole asiner hücreler Thoma hücre sayımı odası kullanarak tam bir mekanik ayrılma sonra, sayılabilir. Izole asiner hücreler daha sonra kültüründe muhafaza edilemez unutmayın.

Elde edilen asiner kültür kalitesi gibi Tripsinojen, Pankreas Transkripsiyon Faktör 1 alt birimi Alpha veya karboksipeptidaz A1 (immünsitokimya veya immünofloresan deneyleri ile) olarak asiner spesifik belirteçler ifade kontrol ederek kontrol edilebilir.

Sonuçlar

Şekil 1 birincil asiner hücrelerin izolasyonu için "dağınık" acini yöntemi şematize etmektedir. Kesinlikle protokolü esnasında yerine getirilmesi gereken kritik adımlar, tartışma kısmında tarif edilmiştir.

Onun çıkarılmasını kolaylaştırmak için, pankreas ekli dalak (Şekil 2) ile birlikte karın tahsil edilmesi gerekir. Her iki ayrı organ kesmek gerekir ve yine de pankreas bağlı olabilir kalıntı yağ dokusu (Basamak 1.6...

Tartışmalar

Bu protokol, pankreas asiner hücreleri izole etmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu yöntem, en az 1 saat, hayvan başına en fazla 20 x 10 ⁶ asiner hücreleri izole etmek mümkün kılar. Hızlı ve basit bir uygulama (10 gibi pankreaslarında bağımsız paralel Deneme başına işlenebilir) sayesinde, bu protokol mevcut izolasyon yöntemleri ^3-5,9-12,17 arasında iyi bir uzlaşma olarak görünür.

Kritik adımları / Sorun Giderme

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Dutscher	146560
10 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357551
100 μm filter	Beckton Dickinson	352360
100 mm Petri dish	Beckton Dickinson	353003
1000 μl filter tips	Starlab	S1122-1830
20 μl filter tips	Starlab	S1120-1810
200 μl filter tips	Starlab	S1120-8810
25 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357535
5 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357543
50 ml polypropylene tube	Beckton Dickinson	352070
6-well plate	Beckton Dickinson	353046
Acetic acid 100%	VWR BDH Prolabo	20104.298
Collagenase IA	Sigma-Aldrich	C2676
Curved forceps, Dumont #7	World Precision Instruments	14188	To sterilize before use
Dissecting scissors, straight	World Precision Instruments	14393	To sterilize before use
Epidermal Growth Factor, human	Promokine	C-60180
Ethanol absolute (AnalaR Normapur)	VWR BDH Prolabo	20821.310
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
Forceps, Dumont #5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Hank's Balanced Salt Solution 1x	Gibco	14025050
HEPES 1 M (pH 6.98-7.30)	Lonza	17-737F
Incubator O2/CO2	Sanyo	MCO-19M
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100
Matrigel	Beckton Dickinson	356234
Microbiological Safety Cabinet, level II	Faster	SafeFast Elite 212 S
Noyes scissors, sharp/sharp tips, German	World Precision Instruments	500228-G	To sterilize before use
Penicillin-Streptomycin mixture	Gibco	15140122
Phosphate Buffer Saline 10x	Gibco	14200067
Pipet-Aid	Drummond Scientific Company	Pipet-Aid XP
Pipetman P1000	Gilson	F123602
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P200	Gilson	F123601
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Scalpel	Paramount Surgimed Ltd.	Disposable Scalpel Size 23
T25 flask, 25 cm2	Sigma-Aldrich	Z707481
Trypsin inhibitor, from Glycine Max	Sigma-Aldrich	T6522
Type I collagen	Beckton Dickinson	354236
Waymouth's medium	Gibco	31220-023