Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

Riepilogo

In questa pubblicazione, si descrive una procedura rapida e conveniente per l'isolamento e la coltura primaria cellule pancreatiche acinose del pancreas murino. Questo metodo costituisce un valido approccio per studiare la fisiologia delle cellule esocrine del pancreas freschi primarie normali / non trasformata.

Abstract

Questo protocollo permette isolamento rapido (in meno di 1 ora) di acini pancreas murino, rendendo possibile mantenerli in coltura per più di una settimana. Più di 20 x 10 ⁶ cellule acinose possono essere ottenuti da un singolo pancreas murino. Questo protocollo offre la possibilità di elaborare separatamente ben 10 pancreases in parallelo. Perché conserva architettura acinose, questo modello è adatto per studiare la fisiologia del pancreas esocrino in vitro in contrasto con linee cellulari stabilizzate da tumori pancreatici, che visualizzano molte alterazioni genetiche conseguente perdita parziale o totale della loro differenziazione acinose.

Introduzione

Un problema riscontrato frequentemente per laboratori di ricerca lavorano su tessuto pancreatico esocrino è la difficoltà di coltivare cellule acinose in vitro per un periodo di tempo sufficientemente lungo da consentire un esperimento a lungo termine.

Un fattore impedendo lo sviluppo di tali sistemi di coltura è la sensibilità intrinseca del tessuto pancreatico di manipolazione sperimentale a causa dell'elevato contenuto di glicolitiche, proteolitica e lipolitica enzimi, che letteralmente digeriscono il tessuto pancreatico quando vengono rilasciate durante l'isolamento delle cellule pancreatiche.

Un secondo fattore è la notevole plasticità in vitro di cellule acinose, che tendono a perdere le loro caratteristiche secretorie e transdifferenziarsi ad altre cellule mature, quali le cellule pancreatiche duttali o cellule epatociti-simili ^1. In vitro, questa plasticità cella varia con le condizioni sperimentali (come composizione mezzo di coltura) ² e introduce un grado di complessità nella progettazione di condizioni di coltura appropriati per le cellule pancreatiche esocrine ^1.

Diversi metodi sono stati sviluppati per l'isolamento e la coltura di cellule acinose, prima della cavia pancreas ^3-5. Inizialmente, tali protocolli coinvolti digestione del tessuto pancreatico con collagenasi, chimotripsina, e un cocktail proteasi, con l'isolamento definitivo da vigoroso dissociazione meccanica. Le cellule pancreatiche isolate in questo modo visualizzati caratteristiche strutturali e funzionali anomale, in particolare una perdita di strutture apicali e danni significativi ai loro recettori di membrana. Cellule isolate rimaste vitali per solo 1 o 2 giorni.

Preparazione di disperso acini mantiene la loro architettura intra-e intercellulare, preservando le membrane cellulari, limitando i danni ai recettori della superficie, e quindi migliorando la secrezione esocrina in risposta ai secretagoghi ^6-8. Come result, questo metodo offre il grande vantaggio di estendere vitalità cellulare acinose per 7-10 giorni in vitro. Inoltre, questo metodo viene attualmente preferito isolamento delle cellule acinose ^9-12 perché la manutenzione dei contatti intercellulari, tra accoppiamento cellula per giunzioni, è un determinante essenziale del pancreatica esocrina acinoso fenotipo delle cellule ^13.

Come dedifferentiation delle cellule acinose e la loro transdifferenziazione di cellule duttali è uno dei meccanismi proposti per la genesi di tumori del pancreas esocrino aggressivi ^14, il modello disperso acini è anche un sistema adeguato per studiare plasticità pancreatica e successive meccanismi molecolari. Inoltre, in combinazione con l'uso di animali geneticamente modificati ^15,16 e lo sviluppo di tecniche di trasferimento genico ⁽² adenovirale o trasduzione lentivirale, uso di nanoparticelle, etc), questo modello in vitro cellule acinose primario puòessere molto utile per determinare come le varie disfunzioni genetiche influenzano la regolazione della differenziazione delle cellule acinose o de-differenziazione e dovrebbero fornire una migliore comprensione degli eventi molecolari responsabili della insorgenza di pancreatite, lesioni precancerose, e cambiamenti nella plasticità delle cellule.

Isolamento dei dispersi acini è l'approccio che usiamo nel nostro laboratorio di cultura pancreatiche cellule dell'acino. Siamo qui descriviamo e discutiamo il metodo utilizzato. Esso comporta dissociazione enzimatica del tessuto pancreatico (con collagenasi batterica) accoppiato a rottura meccanica senza dissociazione delle cellule acinose. Mentre la maggior parte dei protocolli prevedono la coltura degli acini, in sospensione o su substrati plastici appositamente trattati, li cresciamo in sospensione solo brevemente (per 24 ore), la semina loro in seguito su scaffold di matrice se è richiesta la coltura cellulare prolungato.

Questo protocollo permette isolamento rapido (in meno di 1 ora) di dispersi pancreatica acini, sostenibile per più di una settimana di cultura. Esso consente l'isolamento di più di 20 x 10 ⁶ cellule acinose al pancreas mouse. La sua semplicità consente di elaborare in modo indipendente fino a 10 pancreas in parallelo. Mantenendo l'architettura intra-e intercellulare di acini e quindi il fenotipo di cellule acinose primarie isolate, questo modello costituisce un sistema di scelta per lo studio dei meccanismi transdifferenziazione, come tutti gli altri modelli pancreas esocrino attualmente disponibili sono derivate da tumori pancreatici visualizzare molte genetica alterazioni porta alla trasformazione cellulare.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate da un comitato etico sotto regolamentazione dei pubblici poteri ("Comité d'Evaluation Commun Au Centre Léon Bérard, à l'Animalerie de transito de l'ENS, au PBES et au laboratoire P4" (CECCAPP)). I topi sono stati mantenuti in una specifica struttura di animale privo di patogeni presso la "Piattaforma AniCan, Centro Léon Bérard" (Lione, Francia) e trattati in conformità con le linee guida istituzionali.

Una rappresentazione schematica del procedimento è mostrato in Figura 1.

1. Pancreas Dissection e dilacerazione (giorno 0)

Una molto rapida dissezione è critica per una resa ottimale di estrazione e per assicurare una buona vitalità delle cellule in coltura. Per ridurre il tempo necessario per l'isolamento pancreas, tutti gli strumenti e le attrezzature devono essere pronti prima della eutanasia mouse.

1. Euthanize topo da CO ₂ asfissia o dislocazione cervicale.

Da questo punto, tutte le procedure devono essere eseguite sotto un'atmosfera sterile (microbiologica, livello II) con attrezzature dissezione sterile.

2. Fissare il mouse e spruzzare l'addome del mouse con il 70% di etanolo. Con le forbici dissezione e pinze, fare un'incisione a forma di V nella zona genitale e continuare fino al diaframma di aprire completamente la cavità addominale.
3. Posizionare i lobi del fegato contro il diaframma, che devono rimanere lì, se la cavità del corpo è aperta abbastanza lontano. Tirare l'intestino e il colon fuori della cavità addominale alla vostra sinistra, e trovare il retto. Con un paio di pinze curve e forbici dissezione, afferrare e la sezione del retto.
4. Con la stessa coppia di pinze, accuratamente srotolare completamente l'intestino dal retto allo stomaco nell'intestino tirando sulla sinistra.

ent "> In questo passaggio, il pancreas può essere distinto da una piccola striscia tra lo stomaco e l'inizio del viscere. sue legature con la milza rimangono intatti.

5. Utilizzando Noyes forbici e un paio di pinze, tagliare con cautela il pancreas lungo l'intestino e liberare con la milza dal resto del tratto digestivo.
6. Afferrare la sezione di milza e il pancreas collegato ad esso (Figura 2).

In questo passaggio, assicurarsi che nessun tessuto grasso mesenterico e / o di altri tessuti adiacenti (milza, intestino, ecc) potrebbero essere raccolti con il pancreas, per evitare la contaminazione cellulare.

Per il resto della procedura, tutti i buffer devono essere preparate senza calcio ione Ca ^{2 +} chelanti per evitare la completa dissociazione del tessuto pancreatico esocrino nelle cellule acinose singoli.

7. Sciacquare il pancreas due volte in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) 1x.

In questa fase, come tessuto grasso galleggia contraria pancreas che affonderà, è facilmente possibile visualizzare e rimuovere rapidamente il contaminante tessuto adiposo bianco ancora attaccato al pancreas.

Se il pancreas deve essere trasportato alla struttura di coltura cellulare, deve essere tenuta in ghiaccio in HBSS 1x.

8. Trasferire il pancreas in una piastra di Petri sterile contenente 5 ml di HBSS 1x. Utilizzando Noyes forbici e un bisturi, tagliare il pancreas in piccoli pezzi di 1 a 3 mm ³ (Figura 3A).

2. Dissociazioni enzimatica e meccanica di pancreas (giorno 0)

1. Trasferirli in un tubo da 50 ml in polipropilene sterile.
2. Centrifugare per 2 minuti a 450 xg e 4 ° C. Aspirare e scartare il surnatante per rimuovere frammenti di cellule e le cellule del sangue.
3. Aggiungere 10 ml di soluzione di collagenasi IA (HBSS 1x contenente HEPES 10 mm, 200 U / ml di collagenaSE IA, e 0,25 mg / ml di inibitore della tripsina) alle sezioni pancreas. Usando una pipetta sierologica 25 ml, trasferirli su un ² tarato da 25 cm. Incubare per 20-30 minuti a 37 ° C. Durante questo periodo (ogni 5 minuti), eseguire una dissociazione meccanica energicamente spostando avanti e indietro i frammenti di pancreas di circa dieci volte, in pipette sterili di dimensioni decrescenti (25, 10 e 5 ml pipette sierologiche).

In questa fase, è essenziale monitorare frequentemente l'entità della dissociazione enzimatica di sezioni pancreatiche.

4. Quando il tessuto pancreatico sembra essere ben dissociato (secondo la scomparsa di frammenti pancreatici e alla maggiore torbidità della soluzione) (Figura 3B), arrestare la reazione enzimatica aggiungendo 10 ml di soluzione di lavaggio tamponata freddo (1x HBSS contenente 5 % siero fetale bovino (FBS) e 10 mM HEPES).
5. Trasferire in un tubo da 50 ml in polipropilene sterile e centrifuge per 2 min a 450 xg e 4 ° C. Con attenzione aspirare e scartare il surnatante per rimuovere la soluzione di collagenasi IA.
6. Risospendere il pellet e lavare con 10 ml di soluzione di lavaggio tamponata. Centrifugare per 3 minuti a 450 xg e 4 ° C. Con attenzione aspirare e scartare il surnatante. Ripetere questa operazione per altre due volte.

3. Filtrazione e la semina dei Dispersi Acini (giorno 0)

1. Risospendere il pellet cellulare in 7 ml di mezzo di Waymouth contenente 2,5% FBS, 1% penicillina-streptomicina miscela (PS), 0,25 mg / ml di inibitore della tripsina, e 25 ng / ml di fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF).
2. Filtrate il composto cella, consentendo di passare attraverso un 100 micron filtro di trattenere i frammenti non digeriti (condotti, vasi sanguigni, e le isole di Langerhans). Strutture acinose pancreatiche (acino di 10-15 cellule) passano attraverso.
3. Lavare il filtro con 6 ml di terreno contenente FBS di Waymouth, PS, tripsina inhibitor e EGF.

Dopo questo passo, le cellule devono essere trattati con molta attenzione, per evitare qualsiasi acini dissociazione.

4. Seme acini isolato in un piatto di coltura a 6 pozzetti (2 ml per pozzetto) (Figura 3C). Li coltura a 37 ° C sotto 5% (v / v) di CO ₂ nell'atmosfera.

Dopo questo passo, le cellule acinose sono coltivate in sospensione.

4. Acinose Cell Culture (Giorno 1 a 10)

1. Ventiquattro ore dopo, trasferire il acini (in sospensione) in un nuovo piatto di coltura a 6 pozzetti, per eliminare le cellule contaminanti ei residui cellulari che hanno aderito overnight (Figura 4).

Se la coltura cellulare deve essere ampliato per diversi giorni o se le condizioni sperimentali richiedono cellule cresciute in monostrato, si raccomanda di trasferimento e sementi acini sulla matrice scaffold.

2. Il giorno prima di vedereding sul supporto matrice (giorno 0), cappotto un piatto di coltura da 6 pozzetti con collagene di tipo I (5 pg / cm ^2). Aggiungere 1 ml di soluzione di collagene di tipo I (50 ug / ml in 0,02 M di acido acetico, 0,2 micron filtrata) ad ogni pozzetto e permettono di adsorbire passivamente su plastica, durante 1 ora a 37 ° C (o per una notte a 4 ° C ).
3. Aspirare la soluzione di collagene di tipo I e sciacquare il rivestimento ben due volte con PBS 1x.
4. Lasciare che il rivestimento oltre ad asciugare (sotto una cappa di sicurezza microbiologica) almeno 12 ore prima dell'uso.
5. Trasferire l'isolato primario acini (ottenuto nella Fase 4.1) nel collagene tipo I-rivestito piatto di coltura a 6 pozzetti e cultura nelle stesse condizioni come precedentemente descritto (a 37 ° C sotto 5% (v / v) di CO ₂ nell'atmosfera) . Le cellule aderiscono al substrato di collagene di tipo I per 2 giorni.
6. Il giorno 3, modificare il terreno di coltura per eliminare le cellule non vitali, che non hanno aderito. Con il tempo in coltura, le cellule saranno progressivamente spleggere sul supporto contenente collagene. Cambia il terreno di coltura ogni 3 giorni (Figura 5).

Le cellule acinose isolate ottenute possono essere contate, dopo una completa dissociazione meccanica utilizzando una camera di conteggio delle cellule Thoma. Si noti che le cellule acinose isolate non possono essere mantenute in coltura in seguito.

La qualità della cultura acinose ottenuto può essere controllata controllando l'espressione di marcatori specifici acinose quali Trypsinogen, Pancreas Transcription Factor 1 subunità alfa, o Carboxypeptidase A1 (mediante immunocitochimica o esperimenti di immunofluorescenza).

Risultati

La figura 1 schematizza la "dispersa" metodo acini per primario cellule acinose isolamento. Fasi critiche, che devono essere rigorosamente rispettati durante il protocollo, sono descritti nella parte discussione.

Per facilitare la sua rimozione, il pancreas deve essere raccolta dall'addome insieme alla milza allegato (figura 2). Entrambi gli organi devono essere tagliate a parte, e il tessuto grasso residuo che potrebbe essere ancora attaccato ...

Discussione

In questo protocollo, si descrive una procedura per isolare le cellule acinose pancreatiche. Questo metodo rende possibile isolare più di 20 x 10 ⁶ cellule acinose per animale in meno di 1 ora. Grazie alla sua attuazione rapida e semplice (ben 10 pancreas possono essere trattati in modo indipendente per ogni esperimento in parallelo), questo protocollo viene visualizzato come un buon compromesso tra i metodi di isolamento esistenti ^3-5,9-12,17.

Passaggi critici / r...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Dutscher	146560
10 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357551
100 μm filter	Beckton Dickinson	352360
100 mm Petri dish	Beckton Dickinson	353003
1000 μl filter tips	Starlab	S1122-1830
20 μl filter tips	Starlab	S1120-1810
200 μl filter tips	Starlab	S1120-8810
25 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357535
5 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357543
50 ml polypropylene tube	Beckton Dickinson	352070
6-well plate	Beckton Dickinson	353046
Acetic acid 100%	VWR BDH Prolabo	20104.298
Collagenase IA	Sigma-Aldrich	C2676
Curved forceps, Dumont #7	World Precision Instruments	14188	To sterilize before use
Dissecting scissors, straight	World Precision Instruments	14393	To sterilize before use
Epidermal Growth Factor, human	Promokine	C-60180
Ethanol absolute (AnalaR Normapur)	VWR BDH Prolabo	20821.310
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
Forceps, Dumont #5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Hank's Balanced Salt Solution 1x	Gibco	14025050
HEPES 1 M (pH 6.98-7.30)	Lonza	17-737F
Incubator O2/CO2	Sanyo	MCO-19M
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100
Matrigel	Beckton Dickinson	356234
Microbiological Safety Cabinet, level II	Faster	SafeFast Elite 212 S
Noyes scissors, sharp/sharp tips, German	World Precision Instruments	500228-G	To sterilize before use
Penicillin-Streptomycin mixture	Gibco	15140122
Phosphate Buffer Saline 10x	Gibco	14200067
Pipet-Aid	Drummond Scientific Company	Pipet-Aid XP
Pipetman P1000	Gilson	F123602
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P200	Gilson	F123601
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Scalpel	Paramount Surgimed Ltd.	Disposable Scalpel Size 23
T25 flask, 25 cm2	Sigma-Aldrich	Z707481
Trypsin inhibitor, from Glycine Max	Sigma-Aldrich	T6522
Type I collagen	Beckton Dickinson	354236
Waymouth's medium	Gibco	31220-023