Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

Resumo

Nesta publicação, é descrito um procedimento rápido e conveniente para o isolamento e cultura de células acinares pancreáticas primárias do pâncreas murino. Este método constitui uma ferramenta valiosa para o estudo da fisiologia das células primárias normais do pâncreas fresco / não transformada exócrinas.

Resumo

Este protocolo permite o isolamento rápido (em menos de 1 hora) de ácinos pancreáticos de murino, tornando possível mantê-las em cultura durante mais de uma semana. Mais de 20 x 10 ⁶ células acinares podem ser obtidas a partir de um único pâncreas murino. Este protocolo oferece a possibilidade de processar independentemente tantos como 10 pâncreas em paralelo. Porque preserva arquitectura acinar, este modelo é bem adequado para o estudo da fisiologia do pâncreas exócrino, in vitro, em contraste com as linhas de células estabelecidas a partir de tumores pancreáticos, que exibem muitas alterações genéticas, resultando em perda parcial ou total da sua diferenciação acinar.

Introdução

Um problema frequentemente encontrado para laboratórios de investigação úteis em tecido pancreático exócrino é a dificuldade de se cultivar células acinares in vitro durante um período de tempo suficientemente longo para permitir uma experiência de longa duração.

Um factor impedindo o desenvolvimento de tais sistemas de cultura representa a sensibilidade intrínseca do tecido pancreático para manipulação experimental devido ao elevado teor em glicolíticas, proteolítica, lipolítica e de enzimas, que literalmente digerir o tecido pancreático, quando eles são libertados durante o isolamento das células pancreáticas.

Um segundo factor é a notável na plasticidade in vitro de células acinares, que tendem a perder as suas características de secreção e transdiferenciam a outras células maduras, tais como células do ducto pancreático hepatócitos ou células do tipo ^1. In vitro, este plasticidade das células varia de acordo com as condições experimentais (tais como composição do meio de cultura) ² e apresenta um grau de complexidade no design das condições de cultivo apropriadas para células pancreáticas exócrinas ^1.

Vários métodos têm sido desenvolvidos para o isolamento e cultura de células acinares, primeiro a partir do pâncreas de porco da guiné ^3-5. Inicialmente, esses protocolos envolvidos digestão do tecido pancreático com colagenase, quimotripsina, e um cocktail de protease, com isolamento final por dissociação mecânica vigorosa. As células pancreáticas isoladas desta forma exibido características estruturais e funcionais anormais, nomeadamente uma perda de estruturas apicais e danos significativos aos seus receptores de membrana. Células isoladas permaneceu viável por apenas 1 ou 2 dias.

Preparação de ácinos dispersos mantém a sua arquitectura intra e intercelular, preservando as membranas celulares, limitando os danos para os receptores da superfície e, assim, melhorar a secreção exócrina em resposta a secreção de ^6-8. Como result, este método oferece a grande vantagem de prolongar a viabilidade das células acinares de 7-10 dias in vitro. Além disso, este método é actualmente preferido para isolamento de células acinares ^9-12, porque a manutenção de contactos intercelulares, incluindo o acoplamento por junções de hiato célula, é um determinante essencial da pancreática exócrina acinar fenótipo celular ^13.

À medida que a desdiferenciação de células acinares e do seu transdiferenciação de células ductais é um dos mecanismos propostos para a génese de cancros agressivos pancreáticas exócrinas ^14, o modelo ácinos dispersos é também um sistema adequado para estudar a plasticidade do pâncreas e dos seus mecanismos moleculares subsequentes. Além disso, em combinação com a utilização de animais geneticamente modificados ^15,16 e o desenvolvimento de técnicas de transferência de genes (adenovirais ² ou transdução lentiviral, da utilização de nanopartículas, etc), neste modelo in vitro de células acinares primário podeser muito útil na determinação de como diversas disfunções genéticas afectam a regulação da diferenciação de células acinares, ou de desdiferenciação, e deverá proporcionar uma melhor compreensão dos eventos moleculares responsáveis ​​pelo início da pancreatite, lesões pré-cancerosas, e as alterações na plasticidade celular.

Isolamento de ácinos dispersos é a abordagem usamos no nosso laboratório para cultura de células acinares pancreáticas. Nós aqui descrever e discutir o método utilizado. Ele envolve a dissociação enzimática de tecido pancreático (com uma colagenase bacteriana), acoplado ao rompimento mecânico, sem dissociação de células acinares. Enquanto a maioria dos protocolos envolvem a cultura do ácinos, em suspensão ou em substratos de plástico com tratamento especial, nós cultivá-las em suspensão apenas brevemente (por 24 horas), semeando-los depois para andaimes matriz se cultura de células prolongada é necessária.

Este protocolo permite o isolamento rápido (em menos de 1 hora) de corrente alternada dispersos de pâncreasini, sustentável durante mais de uma semana de cultura. Ele permite o isolamento de mais de 20 x 10 ⁶ por células acinares do pâncreas do rato. A sua simplicidade permite processar independentemente tantos como 10 pâncreas em paralelo. Ao manter a arquitectura intra e intercelular de ácinos e assim o fenótipo das células acinares primárias isoladas, este modelo constitui um sistema de escolha para o estudo de mecanismos de transdiferenciação, como todos os outros modelos pancreáticas exócrinas actualmente disponíveis são derivadas de tumores pancreáticos exibindo muitos genética alterações que levam a transformação celular.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados por um comitê de ética sob regulamentação da autoridade governamental ("Comité d'Evaluation Commun au Centre Léon Bérard, à l'Animalerie de trânsito de l'ENS, au PBES et au Laboratoire P4" (CECCAPP)). Camundongos foram mantidos em um biotério livre de patógenos específicos no "Plateforme AniCan, Centro Léon Bérard" (Lyon, França) e tratados de acordo com as diretrizes institucionais.

Uma representação esquemática do procedimento é mostrado na Figura 1.

1. Dissecção pâncreas e dilaceração (Dia 0)

A dissecção muito rápida é crítico para um rendimento óptimo de extracção e para garantir uma boa viabilidade das células em cultura. A fim de reduzir o tempo necessário para o isolamento de pâncreas, de todos os instrumentos e equipamentos devem estar pronto antes da eutanásia do rato.

1. Eutanásia rato por asfixia CO ₂ ou luxação cervical.

A partir deste passo, todos os procedimentos devem ser realizados em um ambiente estéril (gabinete de segurança microbiológica, o nível II) com equipamentos de dissecção estéril.

2. Corrigir o mouse e pulverizar o abdômen do rato com etanol 70%. Com qualquer uma tesoura de dissecção e uma pinça, faça uma incisão em forma de V na área genital e continuá-la até o diafragma para abrir completamente a cavidade abdominal.
3. Posicionar os lóbulos do fígado contra o diafragma, que devem permanecer ali, se a cavidade do corpo é aberta suficientemente longe. Puxe o intestino eo cólon fora da cavidade abdominal, à sua esquerda, e encontrar o reto. Com um par de fórceps curvos e dissecando tesoura, garra e seção do reto.
4. Com o mesmo par de pinças, cuidadosamente desenrole totalmente o intestino do reto para o estômago, puxando o intestino à sua esquerda.

ent "> Neste passo, o pâncreas pode ser distinguido como uma pequena faixa entre o estômago e no início do intestino. suas ligaduras com o baço permanecem intactos.

5. Usando Noyes tesoura e um par de fórceps, cuidadosamente cortadas ao longo do pâncreas e do intestino libertá-la com o baço a partir do resto do tracto digestivo.
6. Pega o baço e o pâncreas secção ligado a ele (Figura 2).

Nesta etapa, certifique-se de que nenhuma gordura mesentérica e / ou outro tecido adjacente (baço, intestino, etc) podem ser coletadas com o pâncreas, para evitar a contaminação celular.

Para o resto do processo, todos os tampões devem ser preparada sem ião de cálcio Ca ^{2 +} agentes quelantes para evitar a dissociação completa do tecido pancreático exócrino em células acinares individuais.

7. Enxaguar o pâncreas duas vezes em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) 1x.

Neste passo, como tecido adiposo irá flutuar ao contrário do pâncreas que se afundará, é facilmente possível visualizar e remover rapidamente o tecido adiposo branco contaminante ainda ligado ao pâncreas.

Se o pâncreas precisa ser transportado para a instalação de cultura de células, deve ser mantido em gelo em HBSS 1x.

8. Transferir o pâncreas em uma placa de Petri estéril contendo 5 ml de HBSS 1x. Usando Noyes tesouras e um bisturi, cortar o pâncreas em pequenos pedaços de 1-3 mm ³ (Figura 3A).

2. Dissociations enzimática e mecânica de pâncreas (Dia 0)

1. Transferi-los para um tubo de polipropileno ml estéril 50.
2. Centrifugar durante 2 minutos a 450 xg e 4 ° C. Aspirar e desprezar o sobrenadante para remover fragmentos de células e células do sangue.
3. Adicionar 10 ml de solução de colagenase IA (1x HBSS contendo 10 mM de HEPES, 200 U / ml de collagenaSE IA, e de 0,25 mg / ml de inibidor de tripsina) de secções de pâncreas. Usando uma pipeta serológica de 25 ml, transferi-los para um balão de 25 ^cm2. Incubar para 20-30 min a 37 ° C. Durante este tempo (5 minutos cada), executar uma dissociação mecânica por energeticamente movimento de vai-e-vem os fragmentos pâncreas cerca de dez vezes, em pipetas estéreis de tamanho decrescente (25, 10, e 5 ml pipetas serológicas).

Neste passo, é frequentemente essencial para controlar a extensão da dissociação enzimática de secções pancreáticas.

4. Quando o tecido pancreático parece ser bem dissociado (de acordo com o desaparecimento de fragmentos pancreáticas e ao aumento da turbidez da solução) (Figura 3B), parar a reacção enzimática por adição de 10 ml de solução de lavagem tamponada fria (HBSS 1x contendo 5 % Soro Fetal Bovino (FBS) e 10 mM de HEPES).
5. Transferi-lo para um tubo de 50 ml de polipropileno estéril e centrifuge durante 2 min a 450 xg e 4 ° C. Aspirar cuidadosamente e descartar o sobrenadante para remover a solução de colagenase IA.
6. Ressuspender o sedimento e lava-se com 10 ml de solução de lavagem tamponada. Centrifugar durante 3 min a 450 xg e 4 ° C. Aspirar cuidadosamente e descartar o sobrenadante. Repita este passo mais duas vezes.

3. Filtração e semeadura de Dispersos Acini (Dia 0)

1. Ressuspender o sedimento celular em 7 ml de meio de Waymouth contendo 2,5% de FBS, 1% de Penicilina-Estreptomicina mistura (PS), 0,25 mg / ml de inibidor de tripsina, e 25 ng / mL de Factor de Crescimento Epidérmico recombinante humana (EGF).
2. Filtra-se a mistura de células, permitindo-lhe passar através de um filtro de 100 um para reter os fragmentos não digeridos (dutos, vasos sanguíneos, e as ilhotas de Langerhans). Estruturas acinares pancreáticas (acinus de 10-15 células) passar.
3. Lavar o filtro com 6 ml de meio contendo FBS de Waymouth, PS, tripsina inhibitor e EGF.

Após este passo, as células têm de ser tratadas com muito cuidado, para evitar qualquer ácinos dissociação.

4. Semente ácinos isolado em uma placa de cultura de 6 poços (2 ml por poço) (Figura 3C). Cultura los a 37 ° C sob 5% (v / v) de atmosfera de CO _2.

Após este passo, as células acinares são cultivadas em suspensão.

4. Acinar Cultura de Células (dia 1 a 10)

1. Vinte e quatro horas depois, transferir os ácinos (em suspensão) para uma nova placa de cultura de 6 poços, para eliminar as células contaminantes e restos celulares que tenham aderido durante a noite (Figura 4).

Se a cultura de células tem de ser alargado durante vários dias, ou se as condições experimentais requerem células cultivadas em monocamada, recomenda-se a transferência e sementes em ácinos matriz andaimes.

2. Um dia antes de verding em apoio matricial (dia 0), casaco de uma placa de cultura de 6 poços com colágeno tipo I (5 mg / cm ^2). Adicionar 1 ml de solução de colagénio do tipo I (50 ug / ml em ácido acético 0,02 M, 0,2 um por filtração) a cada poço e permitir que adsorva passivamente em plástico, durante 1 hora a 37 ° C (ou durante a noite a 4 ° C, ).
3. Aspirar a solução de colágeno tipo I e lavar a poço revestido duas vezes com tampão fosfato 1x.
4. Permitir que o poço revestido para secar (em um gabinete de segurança microbiológica) pelo menos 12 horas antes do uso.
5. Transferir a ácinos primário isolado (obtido no Passo 4.1) para o prato de colagénio tipo I revestido de 6 poços de cultura e da cultura deles em condições idênticas às descritas anteriormente (a 37 ° C sob 5% (v / v) de atmosfera _{de CO2)} . As células aderem ao substrato de colagénio de tipo I durante 2 dias.
6. No Dia 3, mudar o meio de cultura para eliminar as células não viáveis, que não aderiram. Com o tempo na cultura, as células vão progressivamente spler com o apoio contendo colágeno. Alterar o meio de cultura a cada 3 dias (Figura 5).

As células acinares isolados obtidos podem ser contadas, depois de uma completa dissociação mecânica, usando uma câmara de contagem Thoma célula. Note-se que as células acinares isoladas não podem ser mantidas em cultura em seguida.

A qualidade da cultura acinar obtido pode ser controlado por controlo da expressão de marcadores específicos tais como Tripsinogênio acinares, Pâncreas transcription factor 1 subunidade alfa, ou A1 carboxipeptidase (por imunocitoquímica ou experiências de imunofluorescência).

Resultados

A Figura 1 esquematiza o "dispersa" ácinos método para isolamento de células acinares Primária. Os passos críticos, que têm de ser estritamente respeitadas ao longo do protocolo, são descritas na discussão da peça.

Para facilitar a sua remoção, o pâncreas tem que ser coletadas a partir do abdômen, juntamente com o baço em anexo (Figura 2). Ambos os órgãos precisam de ser cortados em pedaços, e os tecidos de gordura residual, que po...

Discussão

Neste protocolo, descrevemos um procedimento para isolar células acinares pancreáticas. Este método torna possível isolar mais do que 20 x 10 ⁶ células acinares por animal, em menos de 1 hora. Graças à sua implementação rápida e simples (até 10 pâncreas podem ser processados ​​de forma independente por cada experiência em paralelo), este protocolo surge como um bom compromisso entre métodos de isolamento existentes ^3-5,9-12,17.

Etapas críticas / r...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Dutscher	146560
10 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357551
100 μm filter	Beckton Dickinson	352360
100 mm Petri dish	Beckton Dickinson	353003
1000 μl filter tips	Starlab	S1122-1830
20 μl filter tips	Starlab	S1120-1810
200 μl filter tips	Starlab	S1120-8810
25 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357535
5 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357543
50 ml polypropylene tube	Beckton Dickinson	352070
6-well plate	Beckton Dickinson	353046
Acetic acid 100%	VWR BDH Prolabo	20104.298
Collagenase IA	Sigma-Aldrich	C2676
Curved forceps, Dumont #7	World Precision Instruments	14188	To sterilize before use
Dissecting scissors, straight	World Precision Instruments	14393	To sterilize before use
Epidermal Growth Factor, human	Promokine	C-60180
Ethanol absolute (AnalaR Normapur)	VWR BDH Prolabo	20821.310
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
Forceps, Dumont #5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Hank's Balanced Salt Solution 1x	Gibco	14025050
HEPES 1 M (pH 6.98-7.30)	Lonza	17-737F
Incubator O2/CO2	Sanyo	MCO-19M
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100
Matrigel	Beckton Dickinson	356234
Microbiological Safety Cabinet, level II	Faster	SafeFast Elite 212 S
Noyes scissors, sharp/sharp tips, German	World Precision Instruments	500228-G	To sterilize before use
Penicillin-Streptomycin mixture	Gibco	15140122
Phosphate Buffer Saline 10x	Gibco	14200067
Pipet-Aid	Drummond Scientific Company	Pipet-Aid XP
Pipetman P1000	Gilson	F123602
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P200	Gilson	F123601
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Scalpel	Paramount Surgimed Ltd.	Disposable Scalpel Size 23
T25 flask, 25 cm2	Sigma-Aldrich	Z707481
Trypsin inhibitor, from Glycine Max	Sigma-Aldrich	T6522
Type I collagen	Beckton Dickinson	354236
Waymouth's medium	Gibco	31220-023