マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

要約

本書では、マウスの膵臓からプライマリー膵臓腺房細胞を単離し、培養するための迅速かつ便利な手順を説明します。この方法では、新鮮な主要形質転換/ノーマル膵外分泌細胞の生理機能を研究するための貴重なアプローチを構成している。

要約

このプロトコルにより、1週間以上の文化でそれらを維持すること、マウス膵臓腺房の​​迅速な分離を（1時間未満）で許可されます。以上20×10 ⁶個^の腺房細胞は、単一のマウス膵臓から得ることができる。このプロトコルは、独立して並行してできるだけ多くの10のような膵臓を処理する可能性を提供しています。それは腺房構造を維持するため、このモデルが十分にそれらの腺房分化の部分的または全体的な損失をもたらす多くの遺伝的変化を表示膵臓腫瘍から樹立細胞株とは対照的に、 インビトロで外分泌膵臓の生理機能を研究するために適している。

概要

膵外分泌組織に取り組んで研究室のために頻繁に遭遇する問題は、十分な長さの長期的な実験を可能にするために一定の期間、in vitroで腺房細胞を培養することの難しさである。

このような培養系の開発を阻害する要因の一つは、それらが膵臓細胞の単離の間に放出されるとき文字通り膵臓組織を消化し、解糖タンパク質分解、および脂肪分解酵素の高い含有量に起因する実験的な操作に膵臓組織の固有感度である。

第二の要因は、その分泌特性を失い、例えば膵管細胞または肝細胞様細胞¹のような他の成熟細胞への分化転換する傾向腺房細胞のin vitroでの著しい可塑性である。 インビトロにおいて 、この細胞可塑性実験条件によって変化する（このような培養培地の組成物として^）2 （商標）と膵外分泌細胞の¹のための適切な培養条件の設計に複雑さの度合いを紹介します。

いくつかの方法がモルモットの膵臓から第^3-5、腺房細胞の単離および培養のために開発されてきた。当初、これらのプロトコルは、精力的な、機械的解離によって究極の分離と、コラゲナーゼ、キモトリプシン、およびプロテアーゼカクテルと共に膵臓組織の消化を関与。このように分離された膵臓細胞、特に異常な構造的および機能的特徴、構造及びそれらの頂端膜受容体に著しい損害の損失を示した。単離された細胞は、わずか1〜2日間に実行可能なままであった。

分散した腺房の調製は、細胞膜を維持表面受容体への損傷を制限するので、分泌^6-8に応答して分泌外分泌を向上させる、それらの細胞内および細胞間のアーキテクチャを維持する。 RESUとしてLTは、この方法は、in vitroで 7-10日に腺房細胞の生存を延長の主な利点を提供しています。ギャップ結合による細胞結合を含む細胞間連絡先のメンテナンスが外分泌膵臓腺房細胞表現型¹³の重要な決定因子であるので、さらに、この方法は、現在^9-12腺房細胞の分離に好適である。

腺房細胞と管細胞への分化の分化は、積極的な膵外分泌癌¹⁴の起源のために提案されたメカニズムの一つであるため、分散した腺房モデルはまた、膵臓の可塑性とその後の分子メカニズムを研究するための適切なシステムである。さらに、遺伝子改変動物^15,16及び遺伝子転写技術の開発^（2アデノウイルス又はレンチウイルス形質導入、ナノ粒子の使用など）の使用と組み合わせて、このインビトロプライマリ腺房細胞モデルにおける缶種々の遺伝的機能不全は、腺房細胞分化または分化の調節に影響を与え、膵炎、前癌病変、および細胞可塑性の変化の開始を担当する分子事象のより良い理解を提供する方法を決定する上で非常に有用である。

分散した腺房の分離は、我々は文化膵臓腺房細胞への我々の研究室で使うアプローチです。私たちは、ここで使用方法を説明し、議論する。これは、腺房細胞の解離せずに機械的破壊に結合された膵臓組織（細菌コラゲナーゼ付き）の酵素的解離を伴う。ほとんどのプロトコルは、培養腺房が関与しながら、どちらか懸濁液中または特別扱いプラスチック基板上に、我々は長期化、細胞培養が必要な場合はマトリックス足場に後でそれらを播種、（24時間）だけ簡潔に懸濁液中で、それらを育てる。

このプロトコルは、分散した膵臓交流の急速な分離を（1時間未満の場合）ができますiniファイル、文化の中で一週間以上の持続可能な。それは、マウスの膵臓あたり20以上×10 ⁶腺房細胞の単離を可能にします。そのシンプルさは、それが可能な独立して並行してできるだけ多くの10のような膵臓を処理することができます。現在利用可能なすべての他の膵外分泌モデルは、多くの遺伝的表示膵臓腫瘍から誘導される細胞内および細胞間の腺房の構造、したがって、単離された初代細胞の腺房表現型を維持することによって、このモデルは、分化メカニズムの研究のための最適なシステムを構成する変化は、細胞形質転換につながる。

プロトコル

すべての手順は、政府機関（ "ComitéD'評価·コミュニケーションズのauセンターレオン·ベラール、ドゥENS、auのPBESらのauラボラトリーP4àL'Animalerieデ·トランジット"（CECCAPP））の規制の下で倫理委員会によって承認された。マウスは "Plateforme AniCan、センターレオン·ベラール"（リヨン、フランス）で、特定の病原体を含まない動物施設で維持や制度のガイドラインに準拠して処理されていました。

手順の概略を図1に示されている。

1。膵臓の解剖と引き裂くこと（0日目）

非常に迅速な解剖は、抽出の最適な収量のために重要であると培養中の細胞の良好な生存能力を保証する。膵臓の分離に必要な時間を低減するために、すべての器具および装置は、マウスの安楽死前の準備でなければならない。

1. CO ₂窒息または頸椎脱臼によりマウスを安楽死させる。

このステップでは、すべての手順は、無菌解剖機器と滅菌雰囲気（微生物安全キャビネット、レベルII）の下で行われなければならない。

2. マウスを修正し、70％エタノールでマウスの腹部をスプレー。任意の解剖ハサミとピンセットで、陰部にV字型の切開を行い、完全に腹腔を開くためにダイアフラムにそれを続けています。
3. ダイアフラムに対して肝臓ローブを置き、体腔が十分開いている場合、彼らはそこに残っているはずです。左手に腹腔外腸とコロンを引き、直腸を見つける。湾曲したピンセットや解剖ハサミ、グラブとセクションと直腸。
4. 鉗子の同じペアを使用すると、慎重に左手に腸を引っ張って完全に直腸から胃に腸をアンロール。

このステップでは、膵臓は、胃や腸の初めの間に小さなストリップとしてENT ">を区別することができます。脾臓とのライゲーションはそのまま残ります。

5. Noyes氏はさみとピンセットを使用して、慎重に腸に沿って膵臓をカットし、消化管の他の部分から脾臓でそれを解放する。
6. 脾臓とセクションそれ（ 図2）に接続されている膵臓をつかむ。

このステップでは、まだ腸間膜脂肪組織および/または他の隣接組織（脾臓、腸など）セルラ汚染を避けるために、膵臓で収集されなかったことを確認してください。

残りの手順は、すべてのバッファは単一腺房細胞における膵外分泌組織の完全な解離を回避するために、カルシウムイオンCa ^{2 +}のキレート剤なしで準備する必要があります。

7. ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）1Xに二度膵臓をすすぐ。

このステップでは、などの脂肪組織では、沈んでしまう膵臓に反して、それはまだ膵臓に付着汚染白色脂肪組織を可視化し、迅速に除去することが容易に可能であるフロートします。

膵臓細胞培養施設に輸送する必要がある場合は、1×HBSSで氷上に維持しなければならない。

8. HBSS 1X 5mlのを含む滅菌ペトリ皿で​​膵臓を転送します。 Noyes氏はさみやメスを使用して1〜3のMM ^3（ 図3A）の小片で膵臓をスライス。

2。膵臓の酵素および機械解離（0日目）

1. 滅菌した50mlポリプロピレンチューブにそれらを転送します。
2. 450 XGと4で2分間遠心℃、吸引し、細胞の破片や血液細胞を除去するために、上清を捨てる。
3. コラゲナーゼIA溶液10ml（HBSS 1×10 mMのHEPES、collagenaの200 U / mlを入れを追加するそれIA、および膵臓部にトリプシンインヒビターを0.25 mg / ml）で。 25ミリリットル血清ピペット使用し、25cm ^2のフラスコに移す。 37℃で20〜30分間それをインキュベート℃にこの時間（5分ごと）に、減少サイズの滅菌ピペット（25、10、および5ミリリットル血清ピペット）で、精力的に10回程度往復膵臓断片を移動することによって、機械的解離を行う。

このステップで、それはしばしば膵臓切片の酵素解離の程度を監視することが不可欠である。

4. 膵臓組織が ​​十分に解離すると思われる場合には（膵臓フラグメントの消失に、溶液の増加した濁度に応じて）（ 図3B）、冷を10ml添加して酵素反応を停止する（HBSS 1×5を含有する洗浄液を緩衝％ウシ胎児血清（FBS）および10mM HEPES）。
5. 滅菌した50mlポリプロピレンチューブとCENTRにそれを移す450×gで2分間、4℃のためifuge慎重に吸引し、コラゲナーゼIAソリューションを削除するには、上清を捨てる。
6. バッファリングされた洗浄溶液10mlでペレットを再懸濁し、洗浄する。 450 XGと4で3分間遠心℃、慎重に上清を吸引して捨てる。このステップを2回以上繰り返します。

3。腺房（0日）を分散し、濾過および播種

1. 2.5％のFBS、1％ペニシリン - ストレプトマイシン混合物（PS）、トリプシンインヒビターを0.25 mg / mlの、組換えヒト上皮成長因子の25 ngの/ mlの（EGF）を含有するWaymouthの媒体から7 mlの細胞ペレットを再懸濁する。
2. ろ液は、非消化断片（管、血管、およびランゲルハンス島）を保持するフィルタが100μmを通過させることにより、細胞混合物。膵臓腺房構造は（10-15細胞の腺房）を通過します。
3. PS、トリプシンINH、Waymouthの含有培地FBS 6mlのとフィルターをすすぐibitor、およびEGF。

このステップの後、細胞は、任意の腺房解離を避けるために、非常に注意深く取り扱われなければならない。

4. シード6ウェル培養皿で孤立房（ウェル当たり2ミリリットル）（ 図3C）。文化それらの中で37℃、5％下C（v / v）のCO ₂雰囲気。

このステップの後、腺房細胞が懸濁液中で培養する。

4。腺房細胞培養（目1〜10）

1. 二十四時間一晩付着（ 図4）している汚染物質の細胞と細胞の残党を排除する、新しい6ウェル培養皿に房を（懸濁液中の）を転送、後。

細胞培養では、数日間または実験条件は、細胞が単層培養が必要な場合、それはマトリックス足場上の転送や種子房に推奨され拡張される必要がある場合。

2. 見前日マトリックスのサポート（0日）に鼎、コートI型コラーゲン（5μgの/ cm ^2）を、6ウェル培養皿。各ウェルにI型コラーゲン溶液（0.02 M酢酸中50μgの/ mlで、0.2μmのフィルター）を1 mlを加え、37℃で1時間の間に、プラスチック上の受動吸着°C（または一晩、それを可能にする4℃で）。
3. I型コラーゲン溶液を吸引除去し、リン酸緩衝生理食塩水1Xで二回うまくコーティングをすすいでください。
4. 使用前（微生物安全キャビネットの下）は、少なくとも12時間を乾燥させるだけでなくコーティングできます。
5. タイプ前述のように同じ条件で私はコラーゲンコート6ウェル培養皿や文化、それら（37℃5％下（v / v）のCO ₂雰囲気）に隔離された主要な腺房を（ステップ4.1で得られた）を転送。細胞は2日間のI型コラーゲンの基板に付着する。
6. 3日目に、付着していない非生存細胞を排除するために培地を変更してください。文化の中で時間とともに、細胞が徐々にSP意志コラーゲン含有担体上でお読みください。 3日ごとに（ 図5）培地を変更します。

得られた単離された腺房細胞は、チャンバを計数トーマセルを使用して、完全な機械的解離した後、計数することができる。孤立した腺房細胞はその後文化の中で維持することができないことに注意してください。

取得した腺房文化の質は、 トリプシノーゲン 、 膵臓転写因子1サブユニットアルファ 、またはカルボキシペプチダーゼA1（免疫または免疫蛍光実験によって）として腺特異的マーカーの発現を確認することにより制御することができます。

結果

図1は、一次腺房細胞の分離のための"分散"腺房方法を図式化。厳密にプロトコルの間に尊重されなければならない重要なステップは、議論の部分で説明されています。

その除去を容易にするために、膵臓は、添付の脾臓（ 図2）と共に腹部から収集しなければならない。両方の器官が離れてカットする必要があり、まだ膵臓に取り付ける...

ディスカッション

このプロトコルでは、膵腺房細胞を単離するための手順を説明する。この方法は、1時間未満で動物枚以上20×10 ⁶個^の腺房細胞を単離することができる。その迅速かつ簡単な実装（のような多くの10と膵臓は独立並行して実験ごとに処理することができます）のおかげで、このプロトコルは、既存の単離法^3-5,9-12,17の間の良好な妥協点として表示されます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Dutscher	146560
10 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357551
100 μm filter	Beckton Dickinson	352360
100 mm Petri dish	Beckton Dickinson	353003
1000 μl filter tips	Starlab	S1122-1830
20 μl filter tips	Starlab	S1120-1810
200 μl filter tips	Starlab	S1120-8810
25 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357535
5 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357543
50 ml polypropylene tube	Beckton Dickinson	352070
6-well plate	Beckton Dickinson	353046
Acetic acid 100%	VWR BDH Prolabo	20104.298
Collagenase IA	Sigma-Aldrich	C2676
Curved forceps, Dumont #7	World Precision Instruments	14188	To sterilize before use
Dissecting scissors, straight	World Precision Instruments	14393	To sterilize before use
Epidermal Growth Factor, human	Promokine	C-60180
Ethanol absolute (AnalaR Normapur)	VWR BDH Prolabo	20821.310
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
Forceps, Dumont #5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Hank's Balanced Salt Solution 1x	Gibco	14025050
HEPES 1 M (pH 6.98-7.30)	Lonza	17-737F
Incubator O2/CO2	Sanyo	MCO-19M
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100
Matrigel	Beckton Dickinson	356234
Microbiological Safety Cabinet, level II	Faster	SafeFast Elite 212 S
Noyes scissors, sharp/sharp tips, German	World Precision Instruments	500228-G	To sterilize before use
Penicillin-Streptomycin mixture	Gibco	15140122
Phosphate Buffer Saline 10x	Gibco	14200067
Pipet-Aid	Drummond Scientific Company	Pipet-Aid XP
Pipetman P1000	Gilson	F123602
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P200	Gilson	F123601
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Scalpel	Paramount Surgimed Ltd.	Disposable Scalpel Size 23
T25 flask, 25 cm2	Sigma-Aldrich	Z707481
Trypsin inhibitor, from Glycine Max	Sigma-Aldrich	T6522
Type I collagen	Beckton Dickinson	354236
Waymouth's medium	Gibco	31220-023