Isolement et culture de cellules primaires de souris acineuses du pancréas

Résumé

Dans cette publication, nous décrivons une procédure rapide et pratique pour les cellules acineuses pancréatiques primaires culture du pancréas murin isoler et. Cette méthode constitue une approche intéressante à étudier la physiologie des cellules pancréatiques exocrines normales / non transformé primaires fraîches.

Résumé

Ce protocole permet d'isoler rapidement (en moins de 1 h) de acini du pancréas murin, ce qui permet de les maintenir en culture pendant plus d'une semaine. Plus de 20 x 10 ⁶ cellules acineuses peuvent être obtenus à partir d'un seul pancréas murin. Ce protocole offre la possibilité de traiter indépendamment jusqu'à 10 pancréas en parallèle. Car elle préserve l'architecture acinaire, ce modèle est bien adapté à l'étude de la physiologie du pancréas exocrine in vitro contrairement aux lignées cellulaires de tumeurs pancréatiques, qui affichent de nombreuses modifications génétiques résultant de la perte partielle ou totale de leur différenciation des cellules acineuses.

Introduction

Un problème fréquemment rencontré dans les laboratoires de recherche travaillant sur ​​le tissu pancréatique exocrine est la difficulté de cultiver des cellules acineuses in vitro pour une période de temps suffisamment longue pour permettre une expérience à long terme.

Un facteur entravant le développement de ces systèmes de culture est la sensibilité intrinsèque du tissu pancréatique à la manipulation expérimentale en raison de la forte teneur en enzymes de la glycolyse, protéolytique et lipolytique, qui digèrent littéralement le tissu pancréatique quand ils sont libérés au cours de l'isolement des cellules pancréatiques.

Un deuxième facteur est la remarquable plasticité in vitro des cellules acineuses, qui ont tendance à perdre leurs caractéristiques sécrétoires et transdifférencier à d'autres cellules matures, telles que les cellules canalaires pancréatiques ou de cellules hépatocytes comme ^1. In vitro, cette plasticité cellulaire varie avec les conditions expérimentales (tels que la composition du milieu de culture) ² et présente un degré de complexité dans la conception des conditions de culture appropriées pour les cellules pancréatiques exocrines ^1.

Plusieurs méthodes ont été développées pour l'isolement et la culture des cellules acineuses, premier du pancréas de porc Guinée ^3-5. Initialement, ces protocoles impliqués digestion du tissu pancréatique avec de la collagénase, la chymotrypsine, et un cocktail de protéase, avec isolation ultime par dissociation mécanique vigoureuse. Les cellules pancréatiques isolés de cette manière affichées caractéristiques structurelles et fonctionnelles anormales, notamment une perte des structures apicales et des dommages importants à leurs récepteurs membranaires. Les cellules isolées sont restées viables pour seulement 1 ou 2 jours.

Préparation de la dispersion acini maintient leur architecture intra-et intercellulaires, en préservant les membranes cellulaires, ce qui limite les dommages aux récepteurs de surface, et d'améliorer ainsi la sécrétion exocrine en réponse aux sécrétagogues ^6-8. Comme une result, cette méthode offre l'avantage majeur de l'extension de la viabilité des cellules acineuses à 7-10 jours in vitro. En outre, cette méthode est actuellement préférable à l'isolement des cellules acineuses ^9-12 parce que l'entretien de contacts intercellulaires, y compris les assemblages de cellules par les jonctions communicantes, est un déterminant essentiel du pancréas phénotype des cellules acineuses exocrine ^13.

Comme la dédifférenciation des cellules acineuses et leur transdifférenciation de cellules canalaires est l'un des mécanismes proposés pour la genèse des cancers du pancréas exocrine agressifs ^14, les acini modèle dispersée est également un système adéquat pour étudier la plasticité du pancréas et de ses mécanismes moléculaires ultérieures. En outre, en combinaison avec l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés ^15,16 et le développement des techniques de transfert de gènes (adénovirus ² ou transduction lentiviraux, l'utilisation de nanoparticules, etc), ce modèle de cellule acineuse primaire in vitro peutêtre très utile pour déterminer comment divers dysfonctionnements génétiques affectent la régulation de la différenciation des cellules acineuses ou dédifférenciation et devraient permettre de mieux comprendre les événements moléculaires responsables de l'apparition d'une pancréatite, des lésions précancéreuses et des changements dans la plasticité cellulaire.

Isolation des dispersé acini est l'approche que nous utilisons dans notre laboratoire pour la culture des cellules acineuses du pancréas. Nous décrivons ici et de discuter de la méthode utilisée. Elle implique la dissociation enzymatique du tissu pancréatique (avec une collagénase bactérienne) couplé à une rupture mécanique sans dissociation des cellules acineuses. Alors que la plupart des protocoles impliquent la culture de la acini, soit en suspension ou sur des substrats plastiques spécialement traités, nous les cultivons en suspension que brièvement (pendant 24 heures), les semis plus tard sur les échafaudages de la matrice si la culture cellulaire prolongé est nécessaire.

Ce protocole permet l'isolement rapide (en moins de 1 h) de dispersion pancréas acini, durable pendant plus d'une semaine de culture. Il permet d'isoler plus de 20 x 10 ⁶ cellules acineuses par le pancréas de souris. Sa simplicité permet de traiter indépendamment jusqu'à 10 pancréas en parallèle. En conservant l'architecture intra-et intercellulaires des acini et donc le phénotype des cellules acineuses des cellules primaires isolées, ce modèle constitue un système de choix pour l'étude des mécanismes de la transdifférenciation, comme tous les autres modèles pancréatiques exocrines actuellement disponibles sont dérivées de tumeurs pancréatiques affichant de nombreuses génétique altérations conduisant à la transformation cellulaire.

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Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par un comité d'éthique en vertu de la réglementation de l'autorité gouvernementale («Comité d'Evaluation Commun au Centre Léon Bérard, à l'Animalerie de transit de l'ENS, au PBES et au laboratoire P4" (CECCAPP)). Les souris ont été maintenus dans une animalerie sans pathogène spécifique à la "Plateforme AniCan, Centre Léon Bérard" (Lyon, France) et traités en conformité avec les directives institutionnelles.

Une représentation schématique de la procédure est illustrée à la figure 1.

1. Dissection du pancréas et Dilacération (jour 0)

Une dissection très rapide est essentiel pour un rendement optimal d'extraction et d'assurer une bonne viabilité des cellules en culture. Afin de réduire le temps nécessaire pour l'isolement du pancréas, tous les instruments et les équipements doivent être prêts avant l'euthanasie de la souris.

1. Euthanasier souris par asphyxie au _CO2 ou la dislocation cervicale.

A partir de cette étape, toutes les procédures doivent être effectuées sous atmosphère stérile (poste de sécurité microbiologique, niveau II) avec du matériel de dissection stérile.

2. Fixer la souris et pulvériser l'abdomen de souris avec de l'éthanol à 70%. Avec des ciseaux et des pinces à disséquer, faire une incision en forme de V à la région génitale et le poursuivre jusqu'à la membrane d'ouvrir complètement la cavité abdominale.
3. Positionner les lobes de foie contre le diaphragme, ils doivent y rester si la cavité du corps est ouverte assez loin. Tirez l'intestin et le colon en dehors de la cavité abdominale à votre gauche, et de trouver le rectum. Avec une paire de pinces et de ciseaux courbes dissection, appui et la section du rectum.
4. Avec la même paire de forceps, déroulez soigneusement entièrement l'intestin par le rectum à l'estomac en tirant l'intestin sur votre gauche.

ent "> À cette étape, le pancréas ne peut être distinguée comme une petite bande située entre l'estomac et le début de l'intestin. Ses ligatures avec la rate restent intacts.

5. Utilisation Noyes ciseaux et une paire de pinces, couper soigneusement le pancréas long de l'intestin et de la libérer de la rate du reste de l'appareil digestif.
6. Prenez la rate et le pancréas section qui s'y rattachent (Figure 2).

À cette étape, assurez-vous qu'aucun tissu adipeux mésentérique et / ou d'autres tissus adjacents (rate, intestin, etc) pourraient être recueillies avec le pancréas, pour éviter toute contamination cellulaire.

Pour le reste de la procédure, tous les tampons doivent être préparés sans ion calcium ^{Ca2 +} chélateurs d'éviter la dissociation complète du tissu pancréatique exocrine dans les cellules acineuses simples.

7. Rincer le pancréas deux fois dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) 1x.

À cette étape, comme les tissus adipeux flottera contrairement à pancréas qui va couler, il est facilement possible de visualiser et de supprimer rapidement le tissu adipeux blanc contaminant encore attaché au pancréas.

Si le pancréas doit être transporté à l'installation de culture de cellules, il doit être conservé sur la glace dans HBSS 1x.

8. Transférer le pancréas dans une boîte de Pétri stérile contenant 5 ml de HBSS 1x. Utiliser Noyes ciseaux et un scalpel, découper le pancréas en petits morceaux de 1 à 3 mm ³ (figure 3A).

2. Dissociations enzymatiques et mécaniques du pancréas (jour 0)

1. Les transférer dans un tube en polypropylène stérile de 50 ml.
2. Centrifuger pendant 2 min à 450 xg et 4 ° C. Aspirer et jeter le surnageant pour éliminer les fragments des cellules et des cellules sanguines.
3. Ajouter 10 ml de solution IA collagénase (HBSS 1x contenant 10 mM HEPES, 200 U / ml de CollagenaSE IA et 0,25 mg / ml d'inhibiteur de trypsine) à des sections de pancréas. Avec une pipette sérologique 25 ml, transférer à un flacon de 25 ^cm2. Incuber pendant 20-30 min à 37 ° C. Pendant ce temps (5 min), effectuer une dissociation mécanique par déplacement énergiquement va-et-vient des fragments de pancréas dizaine de fois, dans des pipettes stériles de taille décroissante (25, 10, et 5 pipettes sérologiques ml).

À cette étape, il est essentiel de surveiller fréquemment la mesure de la dissociation enzymatique des sections du pancréas.

4. Lorsque le tissu pancréatique semble être bien dissocié (en fonction de la disparition de fragments du pancréas et de l'augmentation de la turbidité de la solution) (figure 3B), arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 10 ml de froid tamponnée solution de lavage (HBSS 1x contenant 5 % de sérum foetal bovin (FBS) et HEPES 10 mM).
5. Transférer dans un tube en polypropylène stérile de 50 ml et centrifuge pendant 2 minutes à 450 x g et 4 ° C. Aspirer délicatement et jeter le surnageant pour éliminer la solution IA collagénase.
6. Remettre en suspension et laver le culot avec 10 ml de solution de lavage tamponnée. Centrifuger 3 min à 450 xg et 4 ° C. Aspirer délicatement et jeter le surnageant. Répétez cette étape deux fois.

3. La filtration et l'ensemencement de Dispersés Acini (jour 0)

1. Reprendre le culot cellulaire dans 7 ml de milieu de Waymouth contenant 2,5% de FBS, 1% de pénicilline-streptomycine mélange (PS), 0,25 mg / ml d'inhibiteur de trypsine, et 25 ng / ml de facteur de croissance épidermique humain recombinant (FEM).
2. Filtrer le mélange de cellules en lui permettant de passer à travers un filtre pour retenir les fragments non digérés (canaux, les vaisseaux sanguins, et les îlots de Langerhans) 100 um. structures acineuses pancréatiques (acinus des cellules 10-15) passent à travers.
3. Rincez le filtre avec 6 ml de milieu FBS contenant de Waymouth, PS, trypsine habibitor et EGF.

Après cette étape, les cellules doivent être traitées avec soin, afin d'éviter tout acini dissociation.

4. Seed acini isolé dans une boîte de culture à 6 puits (2 ml par puits) (figure 3C). Culture eux à 37 ° C sous 5% de CO atmosphère (v / v) _2.

Après cette étape, les cellules acineuses sont cultivées en suspension.

4. Acinaire culture cellulaire (jour 1 à 10)

1. Vingt-quatre heures après, transférer les acini (en suspension) dans une nouvelle boîte de culture à 6 puits, afin d'éliminer les cellules contaminantes et les débris cellulaires qui ont adhéré pendant la nuit (figure 4).

Si la culture cellulaire doit être prolongée pendant plusieurs jours ou si les conditions expérimentales exigent cellules cultivées en monocouche, il est recommandé de transfert et de semences acini sur des échafaudages matrice.

2. La veille de voirDing sur la matrice de support (jour 0), manteau une boîte de culture à 6 puits avec collagène de type I (5 mg / cm ^2). Ajouter 1 ml de solution de collagène de type I (50 ug / ml dans l'acide acétique 0,02 M, 0,2 um-filtrée) à chaque puits et permettre de manière passive s'adsorber sur du plastique, pendant 1 h à 37 ° C (ou pendant une nuit à 4 ° C ).
3. Aspirer le type solution de collagène de type I et rincez-le bien couché deux fois avec un tampon phosphate salin 1x.
4. Autoriser l'enduit bien sécher (sous un poste de sécurité microbiologique) au moins 12 heures avant utilisation.
5. Transférer le primaire acini isolé (obtenu à l'étape 4.1) dans le plat je enduite de collagène 6 puits culture et la culture dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment (à 37 ° C sous 5% de CO atmosphère (v / v) ₂₎ Type . Les cellules adhèrent au substrat de collagène de type I pendant 2 jours.
6. Au jour 3, changer le milieu de culture pour éliminer les cellules non viables qui n'ont pas adhéré. Avec le temps, la culture, les cellules vont progressivement splu sur le support contenant du collagène. Changer le milieu de culture tous les 3 jours (Figure 5).

Les cellules acineuses isolées obtenues peuvent être comptés, après une dissociation mécanique complète en utilisant une chambre de comptage de cellule de Thoma. Notez que les cellules acineuses isolées ne peuvent pas être maintenues en culture par la suite.

La qualité de la culture acinaire obtenue peut être contrôlée en contrôlant l'expression de marqueurs spécifiques acinaires comme Trypsinogen, Pancréas Transcription Factor 1 sous-unité alpha, ou Carboxypeptidase A1 (par immunohistochimie ou immunofluorescence expériences).

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Résultats

La figure 1 schématise le "dispersé" méthode acini des cellules d'isolement acinaire primaire. Les étapes critiques, qui doivent être strictement respectées pendant le protocole, sont décrites dans la partie de la discussion.

Pour faciliter son retrait, le pancréas doit être recueillie à partir de l'abdomen avec la rate jointe (figure 2). Les deux organes doivent être coupées à part, et le tissu adipeux résiduel qui pourrait ?...

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Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons une procédure pour isoler des cellules acineuses du pancréas. Cette méthode permet d'isoler plus de 20 x 10 ⁶ cellules acineuses par animal en moins d'une heure. Merci à sa mise en œuvre simple et rapide (moins de 10 pancréas peuvent être traitées indépendamment par expérience en parallèle), ce protocole apparaît comme un bon compromis entre les méthodes d'isolation existants ^3-5,9-12,17.

Les étapes critiq...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Dutscher	146560
10 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357551
100 μm filter	Beckton Dickinson	352360
100 mm Petri dish	Beckton Dickinson	353003
1000 μl filter tips	Starlab	S1122-1830
20 μl filter tips	Starlab	S1120-1810
200 μl filter tips	Starlab	S1120-8810
25 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357535
5 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357543
50 ml polypropylene tube	Beckton Dickinson	352070
6-well plate	Beckton Dickinson	353046
Acetic acid 100%	VWR BDH Prolabo	20104.298
Collagenase IA	Sigma-Aldrich	C2676
Curved forceps, Dumont #7	World Precision Instruments	14188	To sterilize before use
Dissecting scissors, straight	World Precision Instruments	14393	To sterilize before use
Epidermal Growth Factor, human	Promokine	C-60180
Ethanol absolute (AnalaR Normapur)	VWR BDH Prolabo	20821.310
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
Forceps, Dumont #5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Hank’s Balanced Salt Solution 1x	Gibco	14025050
HEPES 1 M (pH 6.98-7.30)	Lonza	17-737F
Incubator O2/CO2	Sanyo	MCO-19M
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100
Matrigel	Beckton Dickinson	356234
Microbiological Safety Cabinet, level II	Faster	SafeFast Elite 212 S
Noyes scissors, sharp/sharp tips, German	World Precision Instruments	500228-G	To sterilize before use
Penicillin-Streptomycin mixture	Gibco	15140122
Phosphate Buffer Saline 10x	Gibco	14200067
Pipet-Aid	Drummond Scientific Company	Pipet-Aid XP
Pipetman P1000	Gilson	F123602
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P200	Gilson	F123601
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Scalpel	Paramount Surgimed Ltd.	Disposable Scalpel Size 23
T25 flask, 25 cm2	Sigma-Aldrich	Z707481
Trypsin inhibitor, from Glycine Max	Sigma-Aldrich	T6522
Type I collagen	Beckton Dickinson	354236
Waymouth’s medium	Gibco	31220-023