Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

Zusammenfassung

In dieser Veröffentlichung beschreiben wir eine schnelle und bequeme Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von primären Azinuszellen des Pankreas von dem murinen Bauchspeicheldrüse. Diese Methode stellt einen wertvollen Ansatz, um die Physiologie der frischen primären normal / transformierten exokrinen Pankreas-Zellen zu studieren.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Trennung (in weniger als 1 Stunde) von Maus Pankreasazini, so dass es möglich ist, sie in der Kultur für mehr als eine Woche halten. Mehr als 20 x 10 ⁶ Azinuszellen aus einem einzigen murine Pankreas gewonnen werden. Dieses Protokoll bietet die Möglichkeit, unabhängig verarbeiten zu 10 Pankreas sind. Weil es acinar Architektur bewahrt, ist dieses Modell auch für das Studium der Physiologie des exokrinen Pankreas in vitro im Gegensatz zu Zelllinien aus Tumoren der Bauchspeicheldrüse, die viele genetische Veränderungen zu einer teilweisen oder vollständigen Verlust ihrer acinar Differenzierung angezeigt gegründet geeignet.

Einleitung

Ein häufig auftretendes Problem für Forschungslabore auf exokrinen Pankreasgewebe ist die Schwierigkeit der Kultivierung Azinuszellen in vitro für einen bestimmten Zeitraum lang genug, um ein langfristiges Experiment erlauben.

Ein Faktor behindern Entwicklung solcher Systeme Kultur ist die intrinsische Empfindlichkeit von Pankreas-Gewebe experimentelle Manipulation durch den hohen Gehalt in glykolytischen, proteolytische und lipolytische Enzyme, die wörtlich verdauen Pankreasgewebe, wenn sie bei der Isolierung von pankreatischen Zellen freigesetzt werden.

Ein zweiter Faktor ist die bemerkenswerte in vitro Plastizität Azinuszellen, die ihre sekretorischen Eigenschaften verlieren und transdifferenzieren anderen reifen Zellen, wie Pankreasgangzellen oder Leber-ähnlichen Zellen ^1. Neigen In vitro variiert diese Zellplastizität mit den experimentellen Bedingungen (z. B. Zusammensetzung des Kulturmediums) ² und stellt ein gewisses Maß an Komplexität in der Gestaltung geeigneter Kulturbedingungen für exokrinen Pankreas-Zellen ^1.

Mehrere Methoden zur Isolierung und Kultur der Azinuszellen, zuerst aus dem Meerschweinchen Bauchspeicheldrüse ^3-5 entwickelt. Zunächst werden die Protokolle Verdauung von Pankreasgewebe mit Kollagenase, Chymotrypsin und einer Protease Cocktail beteiligt, mit ultimativen Isolierung durch kräftiges mechanische Dissoziation. Die Zellen der Bauchspeicheldrüse auf diese Weise isoliert angezeigt abnorme strukturelle und funktionelle Eigenschaften, insbesondere ein Verlust von apikalen Strukturen und erhebliche Schäden an ihrer Membran-Rezeptoren. Isolierte Zellen blieben nur für 1 oder 2 Tage lebensfähig.

Herstellung von dispergierten acini unterhält ihre intra-und interzellulären Architektur, die Erhaltung Zellmembranen, Schadensbegrenzung zu Oberflächen-Rezeptoren und damit die Verbesserung der exokrinen Sekretion in Reaktion auf Sekretagoga ^6-8. Als result, bietet dieses Verfahren den großen Vorteil, sich Azinuszelltumoren Lebensfähigkeit zu 7-10 Tagen in vitro. Darüber hinaus ist dieses Verfahren derzeit Azinuszelltumoren Isolierung ^9-12 da die Wartung der interzellulären Kontakte, darunter Zelle Kopplung durch Gap Junctions, ist eine wesentliche Determinante des exokrinen Pankreas Azinuszelltumoren Phänotyp ¹³ bevorzugt.

Da die Entdifferenzierung von Azinuszellen und ihre transdifferentiation zu duktalen Zellen ist einer der vorgeschlagenen Mechanismen für die Entstehung von aggressiven exokrinen Bauchspeicheldrüsenkrebs ^14, ist die dispergierte acini Modell auch ein geeignetes System zur Pankreas-Plastizität und ihrer späteren molekularen Mechanismen zu studieren. Darüber hinaus in Kombination mit dem Einsatz von gentechnisch veränderten Tieren ^15,16 und die Entwicklung von Gentransfer-Techniken (Adenovirus ² oder lentiviralen Transduktion, Einsatz von Nanopartikeln, etc), diese in vitro primäre Azinuszelltumoren Modell kannsehr nützlich sein, zu bestimmen, wie verschiedene genetische Störungen der Regulierung der Azinuszelltumoren Differenzierung oder Entdifferenzierung beeinflussen und sollte ein besseres Verständnis der molekularen Vorgänge verantwortlich für das Auftreten von Pankreatitis, Krebsvorstufen und Veränderungen in Zellplastizität bieten.

Isolation von dispergierten acini ist der Ansatz, die wir in unserem Labor zu Kultur Azinuszellen des Pankreas. Wir beschreiben und diskutieren die Methode verwendet. Es handelt enzymatische Dissoziation von Pankreasgewebe (mit einer bakteriellen Collagenase) gekoppelt mechanisches Aufbrechen ohne Dissoziation Azinuszellen. Während die meisten Protokolle Kultivieren der Acini, beinhalten entweder in Suspension oder auf speziell behandeltem Kunststoff Substraten wachsen wir sie in Suspension nur kurz (24 Std.), Säen sie anschließend auf einer Matrix Gerüste, wenn längerer Zellkultur erforderlich.

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Trennung (in weniger als 1 Stunde) des Pankreas verteilt acini, nachhaltige für mehr als eine Woche in der Kultur. Es ermöglicht Isolierung von mehr als 20 x 10 ⁶ Zellen pro Maus acinar Bauchspeicheldrüse. Die Einfachheit ist es möglich, unabhängig verarbeiten zu 10 Pankreas sind. Durch die Beibehaltung des intra-und interzellulären Architektur der Acini und damit die acinar Phänotyp der isolierten primären Zellen, stellt dieses Modell ein System der Wahl für die Untersuchung von Mechanismen transdifferentiation, wie alle anderen exokrinen derzeit verfügbaren Modelle von Tumoren der Bauchspeicheldrüse Anzeige von vielen genetischen abgeleitet Änderungen, die zu zellulärer Transformation.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Alle Verfahren wurden durch eine Ethikkommission unter regulatorischen der staatlichen Behörde genehmigt ("Comité d'Auswertung Commun Au Centre Léon Bérard, à l'Animalerie de Transit de l'ENS, au PBEs et au Laboratoire P4" (CECCAPP)). Die Mäuse wurden in einem spezifischen Pathogen-freien tierischen Anlage am "Plateforme AniCan, Centre Léon Bérard" (Lyon, Frankreich) gepflegt und behandelt in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts.

Eine schematische Darstellung des Verfahren ist in Fig. 1 gezeigt.

1. Bauchspeicheldrüse Dissection und Kanalkrümmung (Tag 0)

Eine sehr schnelle Präparation ist für eine optimale Ausbeute der Extraktion und eine gute Lebensfähigkeit der Zellen in der Kultur gewährleisten. Um die Zeit für Pankreas Isolierung erforderlich zu reduzieren, müssen alle Hilfsmittel bereit, bevor der Maus Euthanasie.

1. Euthanize Maus durch CO ₂ Ersticken oder Genickbruch.

Von diesem Schritt müssen alle Verfahren unter einer sterilen Atmosphäre (MSW, Stufe II) mit steriler Dissektion Ausrüstung durchgeführt werden.

2. Befestigen Sie die Maus und die Maus sprühen Bauch mit 70% Ethanol. Mit allen Sezieren Scheren und Zangen, einen V-förmigen Einschnitt an den Genitalbereich und fortsetzen bis die Membran vollständig zu öffnen Sie die Bauchhöhle.
3. Positionieren Sie die Leberlappen gegen die Membran, sie sollten dort bleiben, wenn der Körperhöhle offen ist weit genug. Ziehen Sie den Darm und den Darm außerhalb der Bauchhöhle auf der linken Seite, und finden Sie das Rektum. Mit einem Paar und einer gebogenen Pinzette Präparierscheren, zupacken und Abschnitt das Rektum.
4. Mit der gleichen Pinzette vorsichtig entrollen ganz den Darm aus dem Rektum in den Magen in den Darm, indem auf der linken Seite.

ent "> Bei diesem Schritt kann der Bauchspeicheldrüse als schmaler Streifen zwischen dem Magen und dem Beginn des Darms zu unterscheiden. Die Ligationen mit der Milz erhalten bleiben.

5. Mit Noyes Schere und einer Pinzette vorsichtig schneiden die Bauchspeicheldrüse entlang des Darms und befreien sie mit der Milz von dem Rest des Verdauungstraktes.
6. Besorgen Sie sich die Milz und die Bauchspeicheldrüse Abschnitt attached to it (Abbildung 2).

Bei diesem Schritt sicher sein, dass kein mesenterialen Fettgewebe und / oder andere benachbarte Gewebe (Milz, Darm usw.) mit der Bauchspeicheldrüse gesammelt werden, um zelluläre Kontamination zu vermeiden.

Für den Rest des Verfahrens sind alle Puffer ohne Kalziumionen Ca ^{2 +} Chelatbildner hergestellt werden, um die vollständige Dissoziation des exokrinen Pankreasgewebe in einzelne Azinuszellen vermeiden.

7. Spülen Sie die Bauchspeicheldrüse zweimal in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1x.

Bei diesem Schritt wird als Fettgewebe schweben entgegen Bauchspeicheldrüse, die sinken, ist es leicht möglich, zu visualisieren und schnell entfernen die Verunreinigung weißen Fettgewebe noch Bauchspeicheldrüse angebracht.

Wenn die Bauchspeicheldrüse muss auf die Zellkultur-Anlage transportiert werden, muss es auf dem Eis in HBSS 1x gehalten werden.

8. Übertragen Sie die Bauchspeicheldrüse in einer sterilen Petrischale mit 5 ml HBSS 1x. Mit Noyes Schere und Skalpell, schneiden die Bauchspeicheldrüse in kleine Stücke von 1 bis 3 mm ³ (3A).

2. Enzymatische und mechanische Dissociations der Bauchspeicheldrüse (Tag 0)

1. Übertragen Sie sie in ein steriles 50 ml Polypropylen-Röhrchen.
2. Zentrifuge für 2 min bei 450 xg und 4 ° C. Absaugen und den Überstand verwerfen, um Zelltrümmer und Blutzellen zu entfernen.
3. 10 ml Kollagenase IA-Lösung (HBSS 1x mit 10 mM HEPES, 200 U / ml collagenase IA und 0,25 mg / ml Trypsin-Inhibitor) auf Pankreasschnitte. Mit einem 25 ml serologische Pipette, übertragen Sie sie auf einer 25 cm ^2-Kolben. Inkubieren Sie für 20-30 min bei 37 ° C. Während dieser Zeit (alle 5 min), führen eine mechanische Dissoziation durch energetisch Bewegung hin-und her die Bauchspeicheldrüse Fragmente etwa zehnmal, in sterilen Pipetten von abnehmender Größe (25, 10 und 5 ml serologischen Pipetten).

Bei diesem Schritt ist es wichtig, häufig überwacht, inwieweit der enzymatischen Spaltung von Pankreasschnitten.

4. Wenn das Gewebe der Bauchspeicheldrüse zu gut dissoziiert scheint (nach dem Verschwinden von Pankreas-Fragmente und der erhöhten Trübung der Lösung) (3B), stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 10 ml kaltem gepufferte Waschlösung (HBSS 1x mit 5 % Fetal Bovine Serum (FBS) und 10 mM HEPES).
5. Übertragen in ein steriles 50 ml Polypropylen-Röhrchen und centrifuge für 2 min bei 450 xg und 4 ° C. Vorsichtig absaugen und den Überstand verwerfen, um die Kollagenase IA Lösung zu entfernen.
6. Resuspendieren und waschen das Pellet mit 10 ml gepufferte Waschlösung. Zentrifuge für 3 min bei 450 xg und 4 ° C. Vorsichtig absaugen und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male.

3. Filtration und Seeding von Dispersed Acini (Tag 0)

1. Zellpellet in 7 ml Waymouth-Medium, das 2,5% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin-Gemisch (PS), 0,25 mg / ml Trypsin-Inhibitor und 25 ng / ml rekombinantem humanen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF).
2. Filtrat die Zelle Mischung, indem man es durch ein 100 &mgr; m-Filter, um die nicht verdauten Fragmente (Kanäle, Blutgefäße und Langerhans-Inseln) behalten passieren. Bauchspeicheldrüsenkrebs acinar Strukturen (acinus von 10-15 Zellen) durchlaufen.
3. Spülen Sie den Filter mit 6 ml Medium enthaltenden Waymouth der FBS, PS, Trypsin inhibitor und EGF.

Nach diesem Schritt müssen die Zellen sehr vorsichtig behandelt werden, um jede Acini Dissoziation zu vermeiden.

4. Seed das isolierte acini in einer 6-Well Kulturschale (2 ml pro Well) (3C). Kultur sie bei 37 ° C unter 5% (v / v) CO ₂ Atmosphäre.

Nach diesem Schritt werden die Azinuszellen in Suspension kultiviert.

4. Azinuszelltumoren Kultur (Tag 1 bis 10)

1. Vierundzwanzig Stunden nach, übertragen Sie die Acini (in Suspension) in eine neue 6-well Kulturschale, um die Verunreinigung Zellen und zelluläre Reste, die über Nacht eingehalten haben (Abbildung 4) zu beseitigen.

Wenn die Zellkultur muss für mehrere Tage oder, wenn die experimentellen Bedingungen Zellen in Monolayer gewachsen erfordern, ist es um die Übertragung und Saatgut acini auf Matrix Gerüste empfohlen verlängert werden.

2. Am Tag zuvor zu sehending auf Matrix-Unterstützung (Tag 0), Wappen eine 6-well Kulturschale mit Kollagen Typ I (5 ug / cm ^2). 1 ml der Typ-I-Kollagen-Lösung (50 g / ml in 0,02 M Essigsäure, 0,2 um filtriert) in jede Vertiefung und lassen Sie es passiv adsorbieren auf Kunststoff, während 1 Stunde bei 37 ° C (oder über Nacht bei 4 ° C ).
3. Saugen Sie die Typ-I-Kollagen-Lösung und spülen Sie die beschichteten Wells zweimal mit Phosphat-gepufferte Saline 1x.
4. Lassen Sie das beschichtete gut trocknen (unter einer MSW) mindestens 12 Stunden vor dem Gebrauch.
5. Übertragen der isolierten primären Acini (erhalten in Schritt 4.1) in der Typ-I-Collagen-beschichteten 6-Loch-Kulturplatte und Kultur sie in den gleichen Bedingungen wie zuvor beschrieben (bei ​​37 ° C unter 5% (v / v) CO _{2-Atmosphäre)} . Die Zellen des Typ I-Kollagen Substrat haften für 2 Tage.
6. Am Tag 3, verändern das Kulturmedium zu nicht lebensfähigen Zellen, die nicht eingehalten wurden beseitigen. Mit der Zeit in Kultur werden die Zellen schrittweise spLesen auf das Kollagen-haltige Unterstützung. Ändern Sie das Kulturmedium alle 3 Tage (Abbildung 5).

Die isolierten Azinuszellen erhalten kann gezählt werden, nach einer kompletten mechanischen Dissoziation durch Verwendung einer Zelle Thoma Zählkammer. Beachten Sie, dass isolierte Azinuszellen nicht in Kultur gehalten werden danach.

Die Qualität der acinar Kultur erhalten können, indem die Expression von acinar spezifische Marker wie Trypsinogen, Bauchspeicheldrüse Transcription Factor 1-Untereinheit Alpha oder Carboxypeptidase A1 (Immunzytochemie oder Immunfluoreszenz Experimente) gesteuert werden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Abbildung 1 schematisch die "verteilt" acini Methode zur primären Azinuszellen Isolation. Die entscheidenden Schritte, die streng im Protokoll eingehalten werden müssen, werden in der Diskussion Teil beschrieben.

Um die Entfernung zu erleichtern, hat die Bauchspeicheldrüse vom Abdomen zusammen mit der beigefügten Milz (2) gesammelt werden. Beide Organe müssen auseinander geschnitten werden, und das verbleibende Fettgewebe, die noch an der Bauc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung von pankreatischen Azinuszellen. Dieses Verfahren macht es möglich, mehr als 20 x 10 ⁶ Zellen pro Tier acinar in weniger als 1 h zu isolieren. Dank seiner schnellen und einfachen Implementierung (so viele wie 10 Bauchspeicheldrüsen unabhängig pro Experiment parallel verarbeitet werden), wird dieses Protokoll als guter Kompromiss zwischen bestehenden Isolation Methoden ^3-5,9-12,17.

Kritische Schritte...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Dutscher	146560
10 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357551
100 μm filter	Beckton Dickinson	352360
100 mm Petri dish	Beckton Dickinson	353003
1000 μl filter tips	Starlab	S1122-1830
20 μl filter tips	Starlab	S1120-1810
200 μl filter tips	Starlab	S1120-8810
25 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357535
5 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357543
50 ml polypropylene tube	Beckton Dickinson	352070
6-well plate	Beckton Dickinson	353046
Acetic acid 100%	VWR BDH Prolabo	20104.298
Collagenase IA	Sigma-Aldrich	C2676
Curved forceps, Dumont #7	World Precision Instruments	14188	To sterilize before use
Dissecting scissors, straight	World Precision Instruments	14393	To sterilize before use
Epidermal Growth Factor, human	Promokine	C-60180
Ethanol absolute (AnalaR Normapur)	VWR BDH Prolabo	20821.310
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
Forceps, Dumont #5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Hank’s Balanced Salt Solution 1x	Gibco	14025050
HEPES 1 M (pH 6.98-7.30)	Lonza	17-737F
Incubator O2/CO2	Sanyo	MCO-19M
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100
Matrigel	Beckton Dickinson	356234
Microbiological Safety Cabinet, level II	Faster	SafeFast Elite 212 S
Noyes scissors, sharp/sharp tips, German	World Precision Instruments	500228-G	To sterilize before use
Penicillin-Streptomycin mixture	Gibco	15140122
Phosphate Buffer Saline 10x	Gibco	14200067
Pipet-Aid	Drummond Scientific Company	Pipet-Aid XP
Pipetman P1000	Gilson	F123602
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P200	Gilson	F123601
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Scalpel	Paramount Surgimed Ltd.	Disposable Scalpel Size 23
T25 flask, 25 cm2	Sigma-Aldrich	Z707481
Trypsin inhibitor, from Glycine Max	Sigma-Aldrich	T6522
Type I collagen	Beckton Dickinson	354236
Waymouth’s medium	Gibco	31220-023