Выделение и культивирование Мышь первичные клетки поджелудочной Ацинарных

Резюме

В этой публикации мы описываем быстрый и удобный способ выделения и культивирования первичных панкреатических ацинарных клетках мышиной поджелудочной железы. Этот метод представляет собой ценный подход к изучению физиологии свежих первичных нормальных / нетрансформированному экзокринных клеток поджелудочной железы.

Аннотация

Этот протокол обеспечивает быстрое выделение (менее чем за 1 час) мышиного ацинусов поджелудочной железы, что позволяет поддерживать их в культуре в течение более одной недели. Более 20 × 10 ^{6 клеток} ацинарных могут быть получены из одной мышиной поджелудочной железы. Этот протокол дает возможность независимо обрабатывать целых 10 поджелудочной железы параллельно. Потому что он сохраняет ацинарным архитектуре, эта модель хорошо подходит для изучения физиологии поджелудочной железы внешней секреции в пробирке в отличие от клеточных линий устанавливается с опухолями поджелудочной железы, которые отображают многие генетические изменения в результате частичной или полной потери их ацинарным дифференциации.

Введение

Часто встречается проблема для научно-исследовательских лабораториях работают над экзокринной ткани поджелудочной железы является сложность выращивания ацинарных клеток в пробирке в течение времени, достаточного, чтобы позволить долгосрочный эксперимент.

Одним из факторов, препятствующих развитию таких систем культура представляет собой характеристическую чувствительность ткани поджелудочной железы экспериментальных манипуляций из-за высокого содержания в гликолитических, протеолитические и липолитические ферменты, что буквально переваривают ткани поджелудочной железы, когда они выпущены при выделении клеток поджелудочной железы.

Вторым фактором является замечательным в пробирке пластичность ацинарным клеток, которые, как правило, теряют свои характеристики секреторную и трансформироваться в другие зрелые клетки, такие как клетки протоков поджелудочной железы или гепатоцитов-подобные клетки ^1. В пробирке, эта ячейка пластичности зависит от условий эксперимента (такие, как культура состав среды) ² и вводит степени сложности в конструкцию соответствующие условия культивирования для экзокринных клеток поджелудочной железы ^1.

Некоторые методы были разработаны для выделения и культуры ацинарных клетках, первый из поджелудочной железы морской свинки ^3-5. Первоначально, эти протоколы участвуют пищеварения ткани поджелудочной железы с коллагеназы, химотрипсин и протеазы коктейль, с конечной изоляции интенсивного механического диссоциации. Панкреатических клеток, выделенных таким образом, отображается ненормальное структурные и функциональные характеристики, в частности, потери апикальных структур и значительный ущерб их мембранными рецепторами. Изолированные клетки остаются жизнеспособными в течение только 1 или 2 дней.

Подготовка дисперсных ацинусах поддерживает их внутри-и межклеточных архитектуры, сохранение клеточных мембран, ограничивая повреждение поверхностных рецепторов, и, следовательно, улучшение экзокринной секреции в ответ на секрецию ^6-8. Как RESULt, этот метод предлагает основным преимуществом продления жизнеспособности клетки ацинарным до 7-10 дней в пробирке. Кроме того, этот метод настоящее время предпочтительно, чтобы ацинарных изолятор ^9-12, потому что обслуживание межклеточных контактов, в том числе клетки связи по щелевых контактов, является важной детерминантой экзокринных ацинарных клеток поджелудочной железы фенотип ^13.

Как дедифференцировка ацинарных клеток и их трансдифференцировки в клетках протоков является одним из предлагаемых механизмов для генезиса агрессивных экзокринной рак поджелудочной железы ^14, диспергированные ацинусов модель также адекватной системы для изучения пластичности поджелудочной железы и ее последующего молекулярные механизмы. Кроме того, в сочетании с использованием генетически модифицированных животных ^15,16 и разработка методов переноса генов (аденовирусных ² или лентивирусов трансдукции, использование наночастиц, и т.д.), то в пробирке модель первичной клетки ацинарных можетбыть очень полезны в определении того, как различные генетические дисфункции влияют на регулирование ацинарным дифференцировки клеток или дедифференцировки и должны обеспечить более глубокое понимание молекулярных событий, ответственных за возникновение панкреатита, предраковых поражений, а также изменения в клеточной пластичности.

Выделение дисперсных ацинусах такой подход мы используем в нашей лаборатории культуры ацинарных клетках поджелудочной железы. Мы здесь описания и обсуждения используемого метода. Она включает в себя ферментативной диссоциации ткани поджелудочной железы (с бактериальной коллагеназы), соединенный с механическим разрушением без диссоциации ацинарных клетках. Хотя большинство протоколов, включающих в культивировании ацинусов, либо в суспензии или на специально обработанных пластиковых подложках, мы выращиваем их в суспензии лишь кратко (за 24 часа), посев их впоследствии на матрицу лесов если длительное культуре клеток не требуется.

Этот протокол позволяет быстром отрыве (менее чем за 1 час) дисперсных поджелудочной ACINI, устойчивое для более чем одной недели в культуре. Это позволяет выделить более 20 × 10 ⁶ ацинарных клеток на мышь поджелудочной железы. Его простота позволяет обрабатывать независимо целых 10 поджелудочной железы параллельно. Путем поддержания внутри-и межклеточном архитектуры ацинусов и, таким образом ацинарных фенотип выделенных первичных клетках, эта модель представляет собой систему выбора для изучения трансдифференцировки механизмы, как и все другие модели экзокринной поджелудочной железы в настоящее время являются производными от опухолей поджелудочной железы отображения многих генетических изменения, ведущие к трансформации клеток.

протокол

Все процедуры были одобрены этическим комитетом под регулирующим государственной власти («комитет по оценке Соттип d'Au Centre Леона Bérard, à l'Animalerie де транзитных De L'ENS, AU PBES ET Au Laboratoire P4" (CECCAPP)). Мышей содержали в специфических патогенов вивария при "Plateforme AniCan, Центр Леона Bérard" (Лион, Франция) и обрабатываются в соответствии с ведомственным руководящим принципам.

Схематическое представление процедуры показан на рисунке 1.

1. Вскрытие поджелудочной железы и Dilaceration (День 0)

Очень быстрое вскрытие является критическим для оптимального выхода экстракции и для обеспечения хорошего жизнеспособность клеток в культуре. Для того, чтобы сократить время, необходимое для поджелудочной железы изоляции, все инструменты и оборудование должны быть готовы до мыши эвтаназии.

1. Усыпить мыши, CO ₂ удушья или смещения шейных позвонков.

От этого шага, все процедуры должны быть выполнены в стерильной атмосфере (микробиологические кабинета безопасности, уровень II) стерильным оборудованием рассечение.

2. Исправить мыши и распылить мыши живота с 70% этанола. С любым рассечение ножницами и щипцами, делают V-образный разрез в области половых органов и продолжить его до диафрагмы полностью открыть брюшную полость.
3. Поместите доли печени к диафрагме, они должны остаться там, если полость тела открыт достаточно далеко. Потяните кишечника и толстой кишки вне брюшной полости слева от вас, и найти прямой кишки. С парой пинцетов и рассечение ножницами, захват и раздел прямой кишки.
4. С той же парой щипцов, тщательно раскатать полностью кишечника из прямой кишки в желудок, потянув кишечнике слева от вас.

ных "> На этом этапе, поджелудочная железа могут быть выделены в качестве небольшую полоску между желудком и начала кишечника. Его лигирование с селезенкой остаются нетронутыми.

5. Использование Нойеса ножницы и пинцет, тщательно вырезать поджелудочной железы вдоль кишечника и освободить его с селезенки от остальной части пищеварительного тракта.
6. Захватите селезенки и поджелудочной железы разделе прилагается к нему (рис. 2).

На этом этапе быть уверены, что брыжеечной жировой ткани и / или других соседних тканей (селезенки, кишечника и т.д.) не могут быть собраны с поджелудочной железой, чтобы избежать сотовой загрязнения.

Для остальной части процедуры все буферы должны быть подготовлены без ионов кальция Ca ^{2 +,} энтеросорбенты, чтобы избежать полной диссоциации экзокринной ткани поджелудочной железы в одном ацинарных клетках.

7. Промойте поджелудочной железы в два раза сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) 1x.

На этом этапе, так как жировая ткань будет плавать вопреки поджелудочной железы, которая утонет, легко можно представить себе и быстро удалите загрязнения белой жировой ткани еще привязаны к поджелудочной железе.

Если поджелудочная железа необходимо транспортировать на объект культуры клеток, он должен быть выдерживали на льду в HBSS 1x.

8. Передача поджелудочной железы в стерильную чашку Петри, содержащую 5 мл HBSS 1x. Использование Нойес ножницы и скальпель, нарежьте поджелудочной железы в маленькие кусочки от 1 до ³ мм 3 (рис. 3А).

2. Ферментативных и механической диссоциации поджелудочной железы (День 0)

1. Передача их в стерильную полипропиленовую пробирку 50 мл.
2. Центрифуга в течение 2 мин при 450 х г и 4 ° С. Аспирируйте и отбросить супернатант удалить фрагменты клеток и клеток крови.
3. Добавить 10 мл раствора коллагеназы IA (HBSS 1x, содержащего 10 мМ HEPES, 200 Е / мл collagenaсебе IA и 0,25 мг / мл ингибитора трипсина) в поджелудочной железе секций. Использование 25 мл серологические пипетки, перенести их на 25 см ² колбы. Инкубируют его в течение 20-30 мин при 37 ° С. В течение этого времени (каждые 5 минут), выполнение механической диссоциации энергично перемещение назад и вперед поджелудочной железы фрагменты приблизительно в десять раз, в стерильной пипетки уменьшения размера (25, 10 и 5 мл серологической пипеткой).

На этом этапе важно часто контролировать степень ферментативной диссоциации срезах поджелудочной железы.

4. Когда ткань поджелудочной железы, кажется, хорошо диссоциированных (в соответствии с исчезновением поджелудочной фрагменты и повышенная мутность раствора) (рис. 3В), остановить реакцию, добавив 10 мл холодного буферного промывочного раствора (HBSS 1x содержащий 5 % фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 10 мМ HEPES).
5. Передача его в стерильный 50 мл полипропиленовую трубу и Centrifuge течение 2 мин при 450 х г и 4 ° С. Тщательно аспирата и отбросить супернатант Для удаления раствора коллагеназы IA.
6. Ресуспендируют и мыть гранул с 10 мл буферного промывочного раствора. Центрифуга в течение 3 мин при 450 х г и 4 ° С. Тщательно аспирата и отбросить супернатант. Повторите это действие еще два раза.

3. Фильтрация и заполнения дисперсных Acini (День 0)

1. Ресуспендируют осадок клеток в 7 мл среды Waymouth, содержащей 2,5% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина смесь (PS), 0,25 мг / мл ингибитора трипсина, и 25 нг / мл рекомбинантного человеческого эпидермального фактора роста (EGF).
2. Фильтрат смесь клеток, позволяя ему проходить через сито 100 мкм фильтр, задерживающий непереваренные фрагментов (протоков, кровеносных сосудов и островков Лангерганса). Панкреатических ацинарных структур (ацинусе 10-15 клеток) пройти.
3. Промыть фильтр с 6 мл среды, содержащей Waymouth в FBS, PS, трипсин челibitor и EGF.

После этого шага клетки должны соблюдать особую осторожность, чтобы избежать любых ацинусов диссоциации.

4. Семенной изолированных ацинусов в 6-луночные чашки для культивирования (2 мл на лунку) (фиг.3С). Культура их при 37 ° С в атмосфере 5% (объем / объем) CO ₂ атмосферы.

После этого шага ацинарных клеток культивируют в суспензии.

4. Ацинарных клеточной культуры (День 1 до 10)

1. Через двадцать четыре часа после передачи ацинусов (в виде суспензии) в новую 6-луночные чашки для культивирования, для устранения загрязнения клетки и клеточные остатки, которые присоединились в течение ночи (рис. 4).

Если ячейка культура должна быть продлена на несколько дней или, если условия эксперимента требуют клеток, выращенных в монослой, рекомендуется для передачи и семян ацинусах на леса матрицы.

2. Накануне см.Дин на поддержку матрицы (день 0), герб 6-и культуре блюдо с коллагена типа I. (5 мкг / см ^2). Добавить 1 мл коллагена типа I. раствор (50 мкг / мл в 0,02 М уксусной кислоты, 0,2 мкм фильтра) в каждую лунку и позволить ему пассивно адсорбируют на пластике, в течение 1 часа при 37 ° C (или в течение ночи при 4 ° C ).
3. Аспирируйте коллагена типа I. раствора и промыть лунку дважды забуференный фосфатом физиологический раствор 1x.
4. Разрешить покрытием хорошо высохнуть (при микробиологической безопасности шкаф) по крайней мере 12 ч перед использованием.
5. Передача выделенных первичных ацинусов (полученной на шаге 4.1) в коллагена типа I. покрытием 6-луночный планшет культуры и культуры их в тех же условиях, как описано ранее (при 37 ° С в атмосфере 5% (объем / объем) CO ₂ в атмосфере) . Клетки придерживаться коллагена I типа подложки в течение 2 дней.
6. На 3 день изменить культуральной среде для устранения нежизнеспособные клетки, которые не соблюдают. С течением времени в культуре, клетки будут постепенно SPчитать коллаген содержащих поддержки. Изменить культуральной среды каждые 3 дня (рис. 5).

Выделенные клетки ацинарных получены можно пересчитать, после полной механической диссоциации с помощью подсчета Тома ячейки камеры. Следует отметить, что изолированные клетки ацинарных не может поддерживаться в культуре после этого.

Качество ацинарных культуры, полученной можно контролировать, установив выражение ацинарных маркеров, таких как Трипсиногена, поджелудочной железы фактора транскрипции одна субъединица альфа или карбоксипептидазы A1 (по иммуноцитохимия или иммунофлюоресценции экспериментов).

Результаты

На рисунке 1 схематически "дисперсных" ацинусах метод первичной изоляции ацинарным клеток. Критических шагов, которые должны быть строго и во время протокола, описанные в обсуждении части.

Чтобы облегчить ее удаление, поджелудочная железа должна быть собр...

Обсуждение

В этом протоколе, мы опишем способ выделения ацинарных клетках поджелудочной железы. Этот способ делает возможным выделить более 20 × 10 ⁶ ацинарных клеток на животное в менее чем 1 час. Благодаря быстрой и простой реализации (целых 10 поджелудочной железы может быть независимо обраб...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Dutscher	146560
10 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357551
100 μm filter	Beckton Dickinson	352360
100 mm Petri dish	Beckton Dickinson	353003
1000 μl filter tips	Starlab	S1122-1830
20 μl filter tips	Starlab	S1120-1810
200 μl filter tips	Starlab	S1120-8810
25 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357535
5 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357543
50 ml polypropylene tube	Beckton Dickinson	352070
6-well plate	Beckton Dickinson	353046
Acetic acid 100%	VWR BDH Prolabo	20104.298
Collagenase IA	Sigma-Aldrich	C2676
Curved forceps, Dumont #7	World Precision Instruments	14188	To sterilize before use
Dissecting scissors, straight	World Precision Instruments	14393	To sterilize before use
Epidermal Growth Factor, human	Promokine	C-60180
Ethanol absolute (AnalaR Normapur)	VWR BDH Prolabo	20821.310
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
Forceps, Dumont #5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Hank's Balanced Salt Solution 1x	Gibco	14025050
HEPES 1 M (pH 6.98-7.30)	Lonza	17-737F
Incubator O2/CO2	Sanyo	MCO-19M
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100
Matrigel	Beckton Dickinson	356234
Microbiological Safety Cabinet, level II	Faster	SafeFast Elite 212 S
Noyes scissors, sharp/sharp tips, German	World Precision Instruments	500228-G	To sterilize before use
Penicillin-Streptomycin mixture	Gibco	15140122
Phosphate Buffer Saline 10x	Gibco	14200067
Pipet-Aid	Drummond Scientific Company	Pipet-Aid XP
Pipetman P1000	Gilson	F123602
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P200	Gilson	F123601
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Scalpel	Paramount Surgimed Ltd.	Disposable Scalpel Size 23
T25 flask, 25 cm2	Sigma-Aldrich	Z707481
Trypsin inhibitor, from Glycine Max	Sigma-Aldrich	T6522
Type I collagen	Beckton Dickinson	354236
Waymouth's medium	Gibco	31220-023