דור וטיהור של מכלולי אדם INO80 הכרומטין שיפוץ וSubcomplexes

Summary

פרוטוקול זה מתאר הליך להפקת וטיהור מסוג בר וגרסאות מוטציה של מתחם שיפוץ הכרומטין INO80 האנושי. Epitope מתויג גרסאות של יחידות משנה INO80 באות לידי ביטוי ביציבות בתאי HEK293, ומתחמים שלמים ומתחמים חסרי מערכות ספציפיות של יחידות משנה הם מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה immunoaffinity.

Abstract

מתחמי שיפוץ הכרומטין INO80 להסדיר דינמיקת הנוקלאוזום ונגישות DNA על ידי מזרזות שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP. מתחמי INO80 אדם מורכבים מ14 יחידות משנה חלבון כולל Ino80, ATPase כמו SNF2, המשמש גם כמקטע קטליטי והפיגום להרכבה של המכלולים. פונקציות של יחידות משנה האחרות והמנגנונים שבאמצעותם הם תורמים לפעילות שיפוץ הכרומטין של מתחם INO80 להישאר הבינו היטב, בין שאר בשל האתגר של יצירת מכלולי INO80 בתאים אנושיים או מערכות ביטוי Heterologous. פרוטוקול יופיטר זה מתאר הליך המאפשר טיהור של subcomplexes שיפוץ הכרומטין INO80 האנושי שחסרי מקטע או קבוצת משנה של יחידות משנה. epitope דגל N-סופני מתויג Ino80 cDNA הם הציגו ביציבות לכליה עוברית אנושית (HEK) 293 שורות תאים באמצעות רקומבינציה בתיווך FLP. במקרה שקבוצת משנה של יחידות משנה של מתחם INO80 הוא bדואר שנמחק, אחד מבטא חלבוני Ino80 במקום מוטציה שחסר את הפלטפורמה הנדרשת להרכבה של תת יחידות אלה. באירוע למקטע בודד הוא להיות מדולדל, siRNAs אחד transfects מיקוד למקטע זה לשורת תאי HEK 293 יציבות להביע FLAG tagged Ino80 ATPase. תמציות גרעיניות מוכנות, וimmunoprecipitation FLAG מתבצעת על מנת להעשיר את השברים חלבון המכילים נגזרי Ino80. הקומפוזיציות של subcomplexes INO80 מטוהר לאחר מכן ניתן לנתח באמצעות שיטות כגון immunoblotting, צביעת כסף, וספקטרומטריית מסה. Subcomplexes INO80 וINO80 שנוצר על פי פרוטוקול זה ניתן לנתח נוסף באמצעות מבחני ביוכימיים שונים, אשר מתוארים בפרוטוקול יופיטר הנלווה. השיטות שתוארו כאן יכולות להיות מותאמות ללימודים של התכונות המבניות ותפקודיות של כל שיפוץ הכרומטין רב למקטע של יונקים ומתחמי שינוי.

Introduction

מתחמי שיפוץ הכרומטין משפחת SNF2 אבולוציונית שמורים הם רגולטורים מרכזיים של ארגון הכרומטין ונגישות DNA ^1. מתחמי שיפוץ אלה תמיד כוללים מקטע מרכזי כמו SNF2-ATPase, אשר, במקרים מסוימים, מרכיב בחלבוני אבזר שונים ויוצר מכלולי מקרו מולקולרי רב למקטע. כדי לחקור את הפרטים המולקולריים של תהליך שיפוץ הכרומטין תלוי ATP, זה חשוב להבין את תרומתם של תת קבוצות מסוימות של יחידות משנה ו / או מבני תחום לפעילות של מתחמים. ניתוח מסוג זה דורש את היכולת ליצור מתחמי מוטציה נקיים במיוחד שחסרות יחידות משנה חלבון מסוימות או מבני תחום.

מחקרי מבנה פונקציה קודמים של מתחמי שיפוץ

Protocol

.1 ייצור ותרבות של שורות תאי יציבות HEK293 הבעה באורך מלא או גרסות משתנות של הדגל epitope מתויג Ino80 או יחידות משנה INO80 מורכבות אחרות

1. שיבוט cDNA קידוד באורך מלא או Ino80 ATPase אנושי מוטציה או מקטע INO80 אחר לpcDNA5 / FRT וקטור ביטוי של היונקים עם, תג epitope דגל מסוף N במסגרת.
2. לאשר את הרצף של cDNAs הוכנסו על ידי רצפי DNA לפני שתמשיך.
3. כדי לבצע transfection, לגדול FLP-In HEK293 תאים בצלחות תרבית רקמת 10 סנטימטר במצע המכיל DMEM (הנשר בינונ

תוצאות

איור 1 מציג תרשים זרימה המסכם את הנהלים המשמשים לייצור, לטהר, ולאפיין מתחמי הכרומטין INO80 תלוי ATP אנושיים שיפוץ.

כפי שמודגם באיורים 2 ו -3, נהלים אלה מאפשרים את הדור של שני subcomplexes INO80 הסוג וINO80 הפראי שאין תת י...

Discussion

מחקרים מבניים ותפקודיים של רב למקטע מתחמי שיפוץ הכרומטין יונקים מאאוקריוטים גבוהים כבר הקשו על ידי הקושי של הכנה ביוכימית כמויות שימושיות של מתחמים כגון המכילים יחידות משנה שעברו מוטציה או חסרי יחידות משנה מסוימות לגמרי. ישנם מספר של מכשולים טכניים: ראשית, מניפולצי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cellgro	10-013-CV
Glutamax-I (stablized glutamine)	Life Technologies	35050-079
Fetal Bovine Serum	SAFC	12176C
FuGENE6 transfection reagent	Promega	E2312
Hygromycin B, sterile in PBS	AG Scientific	H-1012-PBS
pcDNA5/FRT vector	Life Technologies	V6010-20
Flp-In HEK293 cells	Life Technologies	R780-07
pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector	Life Technologies	V600520
EZview  Red ANTI-FLAG  M2 Affinity Gel	Sigma	F2426
calf serum	SAFC	12138C
TARGETplus SMARTsiRNA pool	Dharmacon / Thermo Scientific	various
5x siRNA resuspension buffer	Dharmacon / Thermo Scientific	#B-002000-UB-100
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Life Technologies	51985-091
PBS	Cellgro	45000	VWR
TrypLE (trypsin)	Life Technologies	12604
1x FLAG Peptide	Sigma	F3290
Micro Bio-Spin Chromatography Column	Bio-Rad	737-5021
Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)	Amicon	UFC805024	Fisher Scientific
Zeba Desalting Columns	Thermo Scientific	89882
Anti-FLAG M2 antibody, mouse	Sigma	F3165
Anti-FLAG M2 antibody, rabbit	Sigma	F7425
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	P8340
benzonase	Novagen	70664
Equipment	Company
Wheaton Dounce Tissue Grinders	Wheaton	06-435C
JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge	Beckman-Coulter	339080
JA-17 rotor	Beckman-Coulter	369691
10 ml polycarbonate tubes	Beckman-Coulter	355630
70 ml polycarbonate bottles	Beckman-Coulter	355655
Type 45 Ti rotor	Beckman-Coulter	339160
Type 70.1 Ti rotor	Beckman-Coulter	342184
BD Clay Adams Nutator Mixer	BD Diagnostics	15172-203	VWR
Glas-Col Tube/Vial Rotator	Glas-Col	099A RD4512
PCR thermal cycler PTC 200	MJ Research	PTC 200
roller bottle incubator	Bellco biotechnology	353348
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4	Millipore	IPFL07810
lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes	Costar	3207