Nesil ve İnsan INO80 Kromatin Yaptırma Kompleksleri ve subcomplexes saflaştırılması

Özet

Bu protokol oluşturulması ve vahşi tip ve insan INO80 kromatin yeniden şekillenme kompleks mutant versiyon saflaştırılması için bir yöntem tarif etmektedir. Epitop INO80 alt birimlerinin versiyonları kararlı biçimde HEK293 hücrelerinde ifade edilir ve alt birimlerinin kümelerini yoksun tam kompleksleri kompleksleri ve bağışıklık yakınlık kromatografisi ile etiketlenmiş.

Özet

INO80 kromatin remodeling kompleksleri ATP-bağımlı nucleosome biçimlenme katalize ederek nucleosome dinamikleri ve DNA erişilebilirlik düzenler. İnsan INO80 kompleksleri Ino80, katalitik alt birim ve oluşan komplekslerin montajı için yapı iskelesi olarak hizmet, çok SnF2 gibi ATPaz'ın 14 de dahil olmak üzere protein alt birimlerinin oluşur. Diğer alt birimlerin İşlevleri ve INO80 Kompleksin kromatin remodeling etkinliğine katkıda hangi mekanizmalar kötü nedeniyle insan hücreleri veya heterolog ifade sistemlerinde INO80 altparçadan üretme meydan kısmen anlaşılamamaktadır. Bu protokol, JOVE alt birimi ya da alt üniteler bir alt eksik insan INO80 kromatin yeniden şekillenme subcomplexes saflaştırılmasını sağlayan bir prosedür tarif etmektedir. N-terminal FLAG epitopu Ino80 cDNA, kararlı bir şekilde insan embriyonik böbrek (HEK) Flp aracılı rekombinasyon kullanılarak 293 hücre hatları içine yerleştirilen etiketlendi. INO80 kompleksinin alt-birimden oluşan bir alt grup b olduğu takdirdeE olanların bir alt birimlerinin montajı için gerekli platformu eksikliği yerine mutant Ino80 proteinleri ifade, silindi. Durumunda bağımsız bir alt-birimi tükeneceği için, kararlı bir şekilde ifade eden bir FLAG HEK 293 hücre hattı, bu alt-birimini hedef bir transfects siRNA'lar Ino80 ATPaz etiketlendi. Nüklear özütler hazırlandı edilir ve FLAG immüno Ino80 türevlerini ihtiva eden protein fraksiyonları zenginleştirmek için gerçekleştirilir. Saflaştınldı INO80 subcomplexes bileşimleri daha sonra, immüno-lekeleme, gümüş boyama ve kütle spektrometrisi gibi yöntemler kullanılarak analiz edilebilir. Bu protokole uygun olarak elde edilen ve INO80 INO80 subcomplexes buradan sonra, ekteki JOVE protokolde tarif edildiği çeşitli biyokimyasal tahlilleri kullanılarak analiz edilebilir. Burada açıklanan yöntemler herhangi bir memeli çoklu alt birim kromatin yeniden yapısal ve fonksiyonel özellikleri ve değiştirme çalışmaları kompleksleri için adapte edilebilir.

Giriş

Evrimsel olarak korunmuş SnF2 aile kromatin remodeling kompleksleri kromatin organizasyonu ve DNA erişilebilirlik ¹ anahtar regülatörler. Bu kompleksler, remodeling, her zaman, bazı durumlarda, çeşitli yardımcı proteinleri ile toplanır ve çoklu alt birim makro-molekül yığınları oluşturan, merkezi bir SnF2 gibi ATPaz alt-birimi bulunmaktadır. ATP'ye bağımlı kromatin yeniden modelleme süreci molekül ayrıntılarını incelemek için, bu komplekslerin faaliyetlerine alt birimlerde ve / veya alan yapı belirli alt-katkılarını anlamak önemlidir. Bu tür analizler, belirli bir protein alt birimleri veya alan yapı yoksun yüksek düzeyde saflaştırılmış mutan kompleksler üretmek üzere yeteneğini gerektirir.

ATP-bağımlı kromatin yeniden şekillenme komplekslerinin mi yapı-fonksiyon çalışmalarını yaygın (ref ^1-4, örneğin, bakınız) bağlı olarak maya genomuna üstün uygulanabılirliği için maya model sistem üzerine odaklanmıştır. Koruma verilmişortolog biçimlenme kompleksleri arasında birim bileşimi ve işlevsellik, yapısı ve maya yeniden şekillenme komplekslerinin işlevi çalışmalar yüksek ökaryotlar meslektaşlarıyla önemli bilgiler sağladı. Bununla birlikte, takdir türe özgü biçimlenme kompleksler arasında fark kazancı ya da korunmuş alt-birimlerinin korunmuş bölgeler içinde yer alan türe özel alt ünitesi, kazanç ya da korunmuş alt-birimlerinin türe spesifik etki kaybı ve dizi değişkenliğine kaybından kaynaklanan, mevcut. Bu tür farklılıklar prensipte yüksek ökaryotik hücreler yeni moleküler ve hücresel ortamlara uyum için ihtiyaç tarafından tahrik edilebilir. Değil, sadece mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sağlayabilir aynı zamanda ATP-bağımlı kromatin yeniden şekillenme sürecinin temel mekanizmalarına ışık tutuyor, ama çünkü Böylece, daha yüksek ökaryotik yeniden şekillenme komplekslerinin alt birimleri nucleosome yeniden şekillenme sürecine nasıl katkıda anlamak, değerli olan kromatin yapısı tarafından HIG ve gen ekspresyonuOnun ökaryotlar düzenlenir.

Bugüne kadar, sadece biyokimyasal tanımlanan kromatin remodeling kompleksleri ve subcomplexes elde zorluklar nedeniyle kısmen çoklu alt birim memeli kromatin remodeling komplekslerinin yapısal ve işlevsel çalışmalar, orada sınırlı kalmıştır. Bu kısmen immün afinite temizliği kararlı bir şekilde N-terminal FLAG epitopu yabani tip ya da mutant Ino80 ^5-7 sürümlerini etiketli ifade eden insan hücrelerinden sağlam INO80 veya INO80 subcomplexes hazırlamak için kullanıldığı aşağıda tarif edilen prosedürler ile, bu zorlukların şekilde alt (Şekil 1) . Insan hücrelerinden gelen sağlam INO80 kompleksleri elde etmek için, Flp aracılı rekombinasyon kararlı biçimde INO80 kompleksinin alt-birimleri kodlayan ^8-10 FLAG epitopu etiketli cDNA'larını ifade eden transgenik HEK293 hücre soyları meydana getirmek için kullanılır. INO80 alt birimlerinin aşırı ifadesi biraz toksik olduğundan, izole ve seçici kılıfı altında klonal hücre hatları korumak için gerekli olanşulları büyük ölçekli hücre kültürleri genişlemesi için gerekli olan bir çok geçitler boyunca sabit transgen ekspresyonunu sağlamak. Alt birimlerin yalnızca bir alt kümesini içeren küçük INO80 subcomplexes elde etmek için, biz başarılı iki yaklaşım kullanılmıştır (Şekil 2A, B). İlk olarak, belirli bir stably alt birimden ⁵ ile etkileşim için gereken etki eksikliği Ino80 mutant sürümlerini ifade eden HEK293 Flp olarak hücre hatları oluşturmak. Seçenek olarak ise, siRNA aracılı yok etme, uygun bir FLAG-etiketli INO80 alt birimini (yayınlanmamış veriler) ifade eden hücrelerden istenen alt birimi tüketmek için kullanılır. Son olarak, insan INO80 kompleksleri arıtmak için BAYRAK agaroz kromatografisi göre ¹¹ etkili bir şekilde saflaştırılmış INO80 veya INO80 subcomplexes içeren son fraksiyon sitosolik proteinler kirletici varlığının azaltılması, nükleer ekstreler bir INO80 içeren fraksiyonun zenginleştirmek için kullanılır.

Protokol

1. Üretim ve tam uzunluktaki veya FLAG işareti Mutant sürümleri ifade eden HEK293 Sabit bir Hücre Soylarının Kültür epitop Ino80 ya da diğer alt-birimleri INO80 Kompleks

1. Tam uzunlukta ya da mutant insan Ino80 ATPaz ya da in-frame, N-terminal FLAG epitop etiketi olan memeli ifade vektörü pcDNA5 / FRT içine bir INO80 alt birimini kodlayan cDNA klonu.
2. Devam etmeden önce, DNA dizilimi yolu ile eklenen cDNA dizisini doğrulamak.
3. Transfeksiyon gerçekleştirmek için, DMEM (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı),% 5 glutamin ihtiva eden bir ortam içinde 10 cm doku kültür tabaklarında HEK293 hücrelerinde FLP-büyür ve% 10 FBS (fetal inek serumu).
4. Hücreler,% 70 ortak akışkanlığa ulaştığında, toplam hacim içinde, her bir doku kültür tabağına FuGene ™ 6 Transfeksiyon ayıracı 40 ul, uygun pcDNA5 / FRT ekspresyon plazmidi, 0.5 ug, ve Flp rekombinaz kodlayan pOG44, 9.5 ug oluşan bir karışım eklemek 800 ul.
5. 48 saat sonra, trypsinize ve s01:30 plit 10 cm çanaklara doğru bir oranda hücre ve% 5 glutamin,% 10 FCS içeren DMEM içinde onları büyümeye ve 3 için 100 ug / ml higromisin B - 4 hafta. (- 5 gün genellikle her 3) o sararmaya başlar her kültür ortamı değiştirin.
6. FLAG-etiketli proteinin en yüksek seviyede ifade eden pozitif klonların belirlenmesi için, tek tek higromisin B-dirençli koloniler seçmek ve bir 24-çukurlu plaka tek bir kuyusuna transfer edin.
   1. Hücreler 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile ~ 1 ml PBS ve pelet içinde, her bir oyuktan% 80 ortak akışkanlığa, hasat hücrelere ulaşır.
   2. Süpernatanın ayrılmasından sonra, SDS-PAGE numune tampon maddesi, 60 ul hücre pelletini.
   3. SDS sayfa ve FLAG ifadesini izlemek için blot için yeniden süspanse hücre pelet Konusu yarısı yem proteini etiketlendi; gelecek analizleri için diğer yarısını kaydedin.
7. Herhangi bir FLAG-etiketli insan Ino80 protein hücre lizatlarında tespit edilirse, başlangıç ​​klonal hücre popu genişletmek15 cm doku kültür kaplarına bir 24-çukurlu plaka tek kuyulardan hücreler kaplanarak daha da lasyon.
   1. 15 cm'lik kaplar, 50 ml'lik bir konik tüp buz gibi soğuk PBS ile kaynaşık hücrelerin yakınındaki tekrar süspansiyon ve transferi hücreleri hasat etmek.
   2. Ek PBS eklenerek 50 ml'lik bir son hacme getirmek.
   3. Pelet 5 dakika boyunca 1000 x g'de hücreleri ve süpernatan mümkün olduğu kadar çıkarın.
   4. Lys450, 1 ml tampon içinde hücre pelletini (20 mM HEPES-NaOH, pH 7.9, 450 mM NaCI tekrar süspansiyon,% 0.5 Triton X-100, 10 mM KCI, 4 mM _MgCl2, 0.2 mM EDTA,% 10 gliserol, 1 mM DTT, 200 uM PMSF ve 1: 1.000 proteaz inhibitör kokteyli).
      NOT: Burada ve başka yerlerde, her zaman hemen bir deney başlamadan önce tamponlar DTT, PMSF ve proteaz inhibitörü kokteyl ekleyin.
   5. İmmüno-çökelti, anti-Flag agaroz jeli 20 ul kullanılarak elde edilen bütün hücre lizatı proteinleri FLAG-etiketli ve Western lekeleme yolu ile FLAG sıvı kısımlar analiz eder. [Immun ayrıntıları içinoprecipitation prosedürü, adım 5. bakınız]
8. İstediğiniz klonal hücre hatları ¹² dondurulmuş stokları hazırlayın ve kullanılıncaya kadar sıvı azot içinde saklayın.

Rulo şişeler 2. Büyüyen HEK293 Hücre Hatları

INO80 komplekslerin büyük ölçekli hazırlanması için, hücreler kültür içinde 10 - 20 silindir şişeler; her yuvarlanır şişeye tipik bir verim paketlenmiş hücre ~ 1 ml'dir.

1. Her bir silindir için bir şişe, higromisin B olmadan 200 mi DMEM,% 5 glutamin, ve% 10 dana serumu, ekleme
2. Her silindir bir şişe içine tek Yakın-konfluen 15 cm'lik tabağı alınan hücrelerin tüm aktarma
3. Yer rulo 37 ° C inkübatör içine silindir şişe şişeler, 0.2 rpm'de döndürün.
4. Hücreler ~% 70 confluency ulaştığınızda, kapalı dökün ve orta atın.
5. Her şişeye ~ buz 50 ml soğuk PBS ilave edin. Şişe Holding yatay, yavaşça hücre tek tabaka gevşetmek için girdap.
6. 250 mi plast üzere yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler aktarınic konik şişeleri ve buz üzerinde yer.
7. Ek PBS ile silindir şişe durulayın biberon şişesi sırayla aktarma. Çalkalama solüsyonu, artık kesin (tipik olarak yaklaşık 5 şişe yıkamak için kullanılan sonra değil), hücre süspansiyonu ekleyin.
8. 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri.
9. Yavaşça, PBS içinde hücreleri tekrar süspansiyon tek bir 250 ml'lik konik şişe içine bunları birleştirmek ve daha fazla işlem kadar buz üzerinde tutmak.

Başka bir FLAG-etiketli INO80 alt birimini ifade eden hücrelerde INO80 Altbirimlerin 3. siRNA aracılı Nakavt

Tek bir alt birimini eksik INO80 subcomplexes elde etmek için, kullanım FLAG immünolojik stabil bir şekilde eksprese eden shRNA, siRNA ile muamele edilmiş hücreler ya da hücrelerden INO80 kompleksleri arıtılması kolaydır. (Küçük müdahale RNA) transfeksiyon protokolü burada açıklanan "ters" SiRNA 15 cm yemekleri büyüyen HEK293 hücreler için optimize edilmiştir. Protokol hücreler ve sho tek bir 15 cm çanak içinULD gereken hücre sayısına bağlı olarak buna göre ölçeklendirilebilir. SiRNA ile muamele edilmiş hücrelerden INO80 kompleks biyokimyasal olarak faydalı miktarlarda hazırlanması için, tek bir 40 15 cm tabaklarda büyüyen kültürlerden kadar büyütülebilir edilmelidir; paketlenmiş hücre peleti 4 ml - yaklaşık 2, bu verecektir.

1. Stabil 15 cm yemekleri yakın confluency INO80 kompleksinin istenen alt birimi ifade HEK293 hücreleri büyümek.
2. SiRNA yeniden süspansiyon tamponu hacmi ekleme (20 mM KCI, 6 mM HEPES pH 7.5, ve 0.2 mM _MgCI2), yeterli liyofilize siRNA içeren bir tüpe siRNA bir 50 uM stok solüsyonu hazırlanır. Çözelti pipetle yukarı ve aşağı birkaç kez ve siRNA tamamen eritilir sağlamak için, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe nutator.
3. SiRNA'ları ve transfeksiyon ayıracı içeren bir transfeksiyon kokteyl hazırlayın. Çok hafif bir karıştırma ile İndirgenmiş Serum Ortamı 32 ul Lipofektamin RNAiMAX ile 50 uM siRNA stok çözeltisi 10 ul karıştırın ve Opti-MEM, 4 ml eklemek; alDüşük bütün maddeler kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesini.
4. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı.
5. Stabil olarak transfeksiyon için, istenen alt-birimini eksprese INO80 Flp olarak HEK293 hücrelerinin hazırlayın.
   1. Aşama 3.4 İnkübasyon sırasında, RT kez PBS ile 15 cm tabaklarda hücreleri yıkayın.
   2. Onlar plakayı kaldırarak başlar sadece kadar PBS çıkardıktan sonra, 1 ml tripsin hücreleri davranın.
   3. Hemen hücreler tripsinize edildi ve hafifçe karıştırmak için, tam bir ortamda (DMEM +% 5 glutamin +% 10 FBS), 10 ml ilave ediniz. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile hücreler toplanır.
   4. ~ 4 mi, tam bir ortamda hücre pelletini ve bir hemositometre kullanılarak hücre sayısı yeniden süspanse.
   5. ~ 5.4 x 10 ⁶ / ml 'lik bir konsantrasyonda komple ortam hücreleri seyreltin.
6. Her 15 cm çanak, 4 ml transfeksiyon kokteyl ardından 15 ml tam bir kültür ortamı ekleyin. Thoro olan orta ve transfeksiyon kokteyl sağlamak için yavaşça karıştırınızughly karıştırılır. Son olarak, eşit hücrelerini dağıtmak için hafifçe girdap tekrar hücre süspansiyonu ekleyin ve bir ml.
7. 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatörde kültür 60 saat sonra, yavaşça ortam, buz gibi soğuk PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak ve çekirdek özütleri hazırlamak için hemen devam edin.

Nükleer özler 4. hazırlanması

Bu prosedür, Dignam ^13'teki protokole göre modifiye edilmiş ve hücre pelletleri başlangıç ​​boyutuna bağlı olarak da aşağı yukarı ölçekli edilebilir. Tipik haliyle, paketlenmiş hücre topağı verimi nihai nükleer ekstre 1 ml 1 ml. Tüm tamponlar buz soğuk olması ve uygun bir soğuk oda mevcut değilse, bütün aşamalar, soğuk bir odada veya buz üzerinde yapılmalıdır.

1. Çekirdekler izole edilmesi:
   1. Yavaşça 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de (15 veya 50 mi) uygun boyutlu bir hücrelerin konik bir tüp içinde ve spin mezun aktarın.
   2. Süpernatantı ve paketlenmiş hücre pel hacmini ölçmeklet. Paketlenmiş hücre 1 mi, 3 x 10 ~ ⁸ HEK293 hücrelerine karşılık gelir.
   3. 5 paketlenmiş hücre Tampon A hacimleri (: 1.000 proteaz inhibitör kokteyl, 10 mM HEPES, pH 7.9, 1.5 mM _MgCI2, 10 mM KCI ve taze 1 mM DTT, 200 uM PMSF ilave edildi ve 1) ekleyin. Nazik pipetleme hücre pelletini.
   4. Tam 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   5. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de, hücreleri topaklamak ve supernatant çıkarın.
   6. Hücre topağı büyüklüğü Tampon A'da inkübasyon sırasında 2 katı kadar artmalıdır
   7. Tampon A'nın iki paketlenmiş hücre hacimleri hücrelerin tekrar ve uygun büyüklükte bir Dounce doku homojenleştirici için hücre süspansiyonu aktarın. Paketlenmiş hücre az 2 ml ile başlanırsa, bir 7 ml homojenleştirici kullanılması; 2 - 4 ml dolu hücreler, 15 ml homojenleştirici kullanın; ve paketlenmiş hücreler 10 veya daha fazla ml, 40 ml homojenleştirici kullanılır.
   8. Dounce homojenleştirici un SERBEST cam havan eli ile hücre süspansiyonu homojenizeHücrelerin% 90 til% 1 tripan mavisi ile pozitif leke.
   9. JA-17 rotor içinde ya da benzer, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 25,000 xg'de 45 mi, yüksek hızlı santrifüj tüpüne ve spin süspansiyonu aktarın (Malzeme / donatım arasında Tablo).
   10. Nükleer pelet kaynaktan, sitosolik proteinler veya parçalama sırasında çekirdek dışarı sızmasını protein içeren süpernatant, kaldırın.
2. Tuz ile çekirdekleri ayıklanıyor:
   1. Ekleme Tampon C (20 mM HEPES, pH 7.9,% 25 gliserol, 1.5 mM _MgCl2, 0.2 mM EDTA ve taze eklenmiş 1 mM DTT, 200 uM PMSF ve 1: 1.000 proteaz inhibitör kokteyli), nükleer pelet; paketlenmiş hücre hacmi (~ 1 x 10 ⁹ hücre) başlayan her 3 ml 2.5 ml Tampon C kullanın.
   2. Bir cam çubuk ya da bir pipet kullanarak, borunun çeperinden nükleer pelet çıkarmak ve bir uygun büyüklükte bir Dounce homojenleştirici Karışımın tamamını aktarın.
   3. TH homojenleştirilmesiyle çekirdekleri yeniden süspanseBir SERBEST havan eli, iki vuruş ile e karışımıdır.
   4. Soğutulmuş bir behere yeniden süspansiyon haline getirilmiş çekirdek fraksiyonu aktarın. Süspansiyon derin en az 0.5 cm kabı dolduracak şekilde bir beher seçin.
   5. Yavaşça buz üzerinde, bir pipet veya cam çubuk ile süspansiyon karıştırılırken kromatin veya diğer bir çözünür yapıları nükleer proteinlerini ekstre etmek için, kademeli olarak 5 M NaCl damla damla 0.42 M NaCI süspansiyonun tuz konsantrasyonunu arttırmak; 5 M NaCl her eklendikten sonra, çözelti, çok zor akışlı ya da jel benzeri bir hale gelmelidir. M NaCI, aşağıdaki formüle göre, 0.42 M NaCI nihai konsantrasyon elde edilecek şekilde bir çözüm getirmek için gerekli 5 hacim hesaplanır:
      
   6. Dikkatle Tip 45 Ti o bir Tipi 70.1 Ti rotor için 10 ml'lik polikarbonat tüp içine viskoz süspansiyon aktarın (veya eşdeğeri) veya 70 ml polikarbonat şişelerbenzer rotor (Malzeme / Ekipman bkz: İçindekiler) r. 70 ml şişe kullanıyorsanız 10 ml tüpler kullanarak veya kapak takımı ile eğer parafilmle sıkıca kapatılmalıdır.
   7. Yavaş yavaş Nutator ile 30 dakika boyunca 4 ° C'de kapalı tüpler sallayın.
   8. 4 ° C'de 120,000 x g'de, Tip 45 Ti veya 30 dakika boyunca 70.1 Ti rotor içinde örnekleri dönerler.
   9. Tek bir plastik tüp veya şişe süpernatant aktarın. Bu yüzer madde çekirdek ekstraktı, ve topak kromatin ve diğer nükleer artıkları içerir.
   10. , Elverişli ölçülü kısma bölün nükleer ekstre sıvı azot içinde dondurularak ve -80 ° C'de saklayın.

İnsan ya da INO80 INO80 subcomplexes 5. immün afinite temizliği

1. Dondurulmuş nükleer ekstre çözülme için, donmuş madde kadar el arasında tezgah üstü ya da hareket borular üzerindeki özü içeren bir yer tüpleri, bir bulamaç haline gelir. Özü tamamen t kadar Sonra buz üzerinde veya soğuk odada tüplerihawed.
2. Donma-çözülme devresi sırasında oluşabilen çökeltinin ayrılması için bir Tip 70.1 Ti rotor veya eşdeğeri, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 100,000 x g'de 10 mi çözülmüş nükleer polikarbonat ultra santrifüj tüplerine çıkarma ve döndürme aktarın.
3. 15 ml konik tüp süpernatant aktarın. 1000 Proteaz İnhibitörü Kokteyli: 1 mM DTT, 200 uM PMSF ve 1 nihai konsantrasyonlarda taze DTT PMSF ve protease inhibitör karışımı ekleyin.
4. , Immün-anti-FLAG agaroz hazırlamak uç temiz bir bisturi ile kesilip edilmiş olan bir ucu olan bir P200 ya da benzer bir pipet kullanılarak bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne anti FLAG agaroz taneleri% 50 bulamaç 200 ul aktarmak veya jilet.
5. 30 saniye için 8000 x g hızında çalışan tezgah üstü bir mikrosantrifüj içinde santrifüjleme ile boncuk Pelet. Süpernatantı, Lys450 ve 1 ml tampon içinde süspansiyon haline getirilerek boncuk boncuk yıkayın ve 30 saniye boyunca 8000 x g'de boncuk pelet. B yıkayıniki kez daha EADS.
6. Uç temiz bir bisturi ya jilet ve aynı ucu kullanılarak transfer ile kesilmiş olan başka bir ucu ile bir P200 ya da benzer bir ayarlanabilir hacimli bir pipet kullanarak nükleer ekstre yaklaşık 100 ul yıkanmış anti FLAG agaroz boncuk tekrar Ekstraktı içeren 15 ml'lik konik tüpe yeniden süspansiyon haline boncuk. Boncuklar her 15 ml'lik bir tüpe transfer edilmiştir kadar birkaç kez tekrarlanır.
7. Laboratuar rotator yavaş dönme ile, 4 ° C de 4 saat boyunca özü / boncuk karışımı inkübe edin. İSTEĞE BAĞLI: DNA safsızlığı uzaklaştırmak için 25 ünite / ml arasında bir konsantrasyonda Benzonase Dahil.
8. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile FLAG agaroz toplayın.
9. 10 mi Lys450 içinde süspanse yıkama, nazik bir nutator sallanarak 4 ° C'de 5 dakika inkübe etmek. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de boncuk Pelet.
10. 1.5 ml mikrosantrifüj tüp Lys450 ve transfer boncuk 150 ul - 100 süspanse edin. Coher boncuk mikrosantrifüj tüpüne aktarılmış kadar Lys450 150 ul - ntinue 100 ile 15 ml konik tüp durulayın.
11. Bir mikrosantrifüj içinde 4 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 8000 x g'de boncuk aşağı dönerler. 1ml EB100 tamponu (10 mM HEPES pH 7.9,% 10 gliserol, 100 mM NaCl, 1.5 mM _MgCI2,% 0.05 Triton X-100 ve taze eklenmiş 1 mM DTT, 200 uM PMSF ile bir defa 1 mi Lys450 ile üç kat daha fazla yıkayın ve 1: 1.000 proteaz inhibitör kokteyli).
12. , Bağlı proteinleri elüte 0.25 mg / ml 1 x FLAG peptidi içeren 200 ul tampon EB100 ekleyin. Bir nutator 4 ° C'de her biri 30 dakika inkübe edin.
13. Bir mikrosantrifüj içinde 4 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 8000 x g'de boncuk Pelet. Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne, taşınan INO80 kompleksini içeren süpernatant aktarın.
14. Elüsyon, dört kez daha tekrarlayın, ve tek bir tüpün içine tüm süpernatantlar bir araya getirirler.
15. Ayrıştırılan protein fraksiyonundan kalan FLAG agaroz taneleri uzaklaştırmak için,Boş bir dönüşlü kolonu eluatının geçmektedir.
16. Yıkanan protein fraksiyonu konsantre ~ 10 kat, ultra santrifüj filtre tertibatı (50,000 molekül ağırlıklı akış kesici) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
17. FLAG peptidi uzaklaştırmak için, iki tuz giderme kolonlarından konsantre edilmiş protein fraksiyonu, sırasıyla geçer.
18. Sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C'de saklanır, 20 ul alikotları saflaştırılmış, tuzdan arındırılmış protein parçasının bölün.
19. Gümüş lekeli jeller üzerinde veya western blotting ile INO80 veya INO80 subcomplexes altbirim kompozisyon analiz ve standartlar gibi bilinen konsantrasyonda rekombinant INO80 alt birimlerinden preparatlar kullanılarak yarı-niceliksel Western blotting ile bunların konsantrasyonlarını tahmin ediyoruz.

Sonuçlar

Şekil 1 oluşturmak arındırmak ve insan INO80 ATP'ye bağımlı kromatin yeniden şekillenme kompleksleri karakterize etmek için kullanılan prosedürleri özetleyen bir akış şemasını göstermektedir.

Şekil 2 ve 3'te gösterildiği gibi, bu işlemler böylece INO80 ait enzimatik aktivite için bu alt-birimlerin eksik katkı müteakip biyokimyasal analizler sağlayan çeşitli altbirimleri taşımayan vahşi tip INO80 ve INO...

Tartışmalar

Yüksek Ökaryotlardaki çok altbirimli memeli kromatin remodeling komplekslerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalar mutant birimlerini içeren veya tamamen belli altbirimden yoksun bu tür komplekslerin biyokimyasal yararlı miktarlarda hazırlanması zorluk tarafından engellenmiştir. İlk olarak, memeli hücrelerinde genetik manipülasyon teknik zorlu ve zaman alıcı olmuştur: teknik engellerin vardır. Genomu kolaylıkla Recombineering teknikler kullanılarak düzenlenebilir ve hedef olabilir, maya hücreleri...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cellgro	10-013-CV
Glutamax-I (stablized glutamine)	Life Technologies	35050-079
Fetal Bovine Serum	SAFC	12176C
FuGENE6 transfection reagent	Promega	E2312
Hygromycin B, sterile in PBS	AG Scientific	H-1012-PBS
pcDNA5/FRT vector	Life Technologies	V6010-20
Flp-In HEK293 cells	Life Technologies	R780-07
pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector	Life Technologies	V600520
EZview  Red ANTI-FLAG  M2 Affinity Gel	Sigma	F2426
calf serum	SAFC	12138C
TARGETplus SMARTsiRNA pool	Dharmacon / Thermo Scientific	various
5x siRNA resuspension buffer	Dharmacon / Thermo Scientific	#B-002000-UB-100
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Life Technologies	51985-091
PBS	Cellgro	45000	VWR
TrypLE (trypsin)	Life Technologies	12604
1x FLAG Peptide	Sigma	F3290
Micro Bio-Spin Chromatography Column	Bio-Rad	737-5021
Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)	Amicon	UFC805024	Fisher Scientific
Zeba Desalting Columns	Thermo Scientific	89882
Anti-FLAG M2 antibody, mouse	Sigma	F3165
Anti-FLAG M2 antibody, rabbit	Sigma	F7425
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	P8340
benzonase	Novagen	70664
Equipment	Company
Wheaton Dounce Tissue Grinders	Wheaton	06-435C
JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge	Beckman-Coulter	339080
JA-17 rotor	Beckman-Coulter	369691
10 ml polycarbonate tubes	Beckman-Coulter	355630
70 ml polycarbonate bottles	Beckman-Coulter	355655
Type 45 Ti rotor	Beckman-Coulter	339160
Type 70.1 Ti rotor	Beckman-Coulter	342184
BD Clay Adams Nutator Mixer	BD Diagnostics	15172-203	VWR
Glas-Col Tube/Vial Rotator	Glas-Col	099A RD4512
PCR thermal cycler PTC 200	MJ Research	PTC 200
roller bottle incubator	Bellco biotechnology	353348
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4	Millipore	IPFL07810
lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes	Costar	3207