במבחנה הדגם של פיזיולוגי ופתולוגיים זרימת דם עם בקשה לחקירות של שיפוץ תא דם

Summary

פרוטוקול זה משכפל את זרימת דם פיזיולוגית או פתולוגי במבחנה כדי לסייע בקביעת תגובת תא בפתולוגיות מחלה. על ידי החדרת לחץ דעיכת הקאמרית במורד הזרם של משאבת דם, זרימת דם בכלי הדם ברחבי ניתן סכמה והוטלה על monolayer של האנדותל של כלי דם או תרבות משותפת כוזב.

Abstract

מחלת כלי דם היא סיבה שכיחה למוות בארצות הברית. במסמך זה, אנו מציגים שיטה לבחון את התרומה של זרימת דינמיקה לקראת פתולוגיות מחלת כלי דם. עורקים בריאים לעתים קרובות נוכחי עם קיר התקשות, צלקות, או היצרות חלקית אשר עשוי להשפיע על כל שיעורי זרימת נוזל, ואת הגודל של זרימה פועמת, או מדד pulsatility. שכפול של תנאי זרימה שונים הוא התוצאה של כוונון לחץ זרימת דעיכת קאמרית במורד הזרם של משאבת דם. מבוא של אוויר בתוך מערכת זרימה סגורה מאפשר למדיום דחיסה לספוג לחץ פועם מהמשאבה, ולכן משתנה מדד pulsatility. השיטה המתוארת במסמך זה היא פשוט לשכפל, עם קלט השליטה ביותר, ותוצאות ניתן למדוד בקלות. מגבלות מסוימות הן בילוי של צורת גל המורכבת הפיזיולוגית הדופק, שנאמד רק על ידי המערכת. תאי אנדותל, תאי שריר חלק, ופיברובלסטים מושפעים זרימת דם through העורק. הרכיב הדינמי של זרימת דם נקבע על ידי עמידת פלט ודפנות העורקים של הלב. mechano-התמרה תא כלי דם של זרימת דינמיקה עלולה לעורר שחרור ציטוקינים והצטלבות בין סוגי תאים בתוך העורק. שיתוף התרבות של תאי כלי דם היא אינטראקציה תאי תאי תמונה המשקפת מדויקת יותר על קיר כלי דם ותגובת כלי דם לאיתות מכאנית. תרומה של זרימת דינמיקה, כולל תגובת התא למרכיבים הדינמיים וממוצעים (או יציבים) של זרימה, ולכן מדד חשוב בקביעת פתולוגיה מחלה ויעילות טיפול. באמצעות החדרת מודל שיתוף תרבות במבחנה ולחץ דעיכת במורד הזרם של משאבת דם אשר מייצרת תפוקת לב מדומה, פתולוגיות מחלת עורקים שונות עשויים להיחקר.

Introduction

שיעורי תחלואה במחלות לב וכלי דם הם הגדולים ביותר באמריקה, עם רבים כתוצאה מכלי דם בריאים. עורקים בריאים מורכבים של רקמה אלסטית, עם משטח luminal רך מצופה monolayer תא האנדותל (EC). זרימה בעורקים עשויה להיות מודל כפונקצית גל נדנוד עם שיעור זרימה ממוצע חיובי. מדד pulsatility (PI) הוא המנה של גודל תנודה ואומר זרימה (PI = (מקס -.. מינ ') / Mean), ¹ וכבר דגם במבחנה עם גמישות כלי משתנה ² גמישות עורקים חשובה באחסון של זרימה. אנרגיה מהתכווצויות לב, מתרחב בלחץ הסיסטולי, וממלא תפקיד משמעותי בויסות זרימת דם לצרכן. כי הלב שומר עקבי, pulsatile, זרימת נפחית, הרחבת עורקים מגבירה שטח חתך, שיפור זרימת יציבות על ידי הקטנת מהירות זרימה, מאמץ גזירה, וצרכן. לעתים קרובות, שינויי עורקים בריאים נוכחי לגמישותאו עמידה, בו מוצגות התקשות משיפוץ כלי דם, רקמת צלקת או הסתיידות ^{3, 4.} בנוסף, הפרעות אחרות של כלי דם, כגון היפרפלזיה neointimal (NIH), ⁵ מפרצת ויתר לחץ דם ⁶ וסיסטיק כלי דם ^4, עלולות להצר קוטר כלי. עם זאת, טיפול תרופתי וטיפול הנוכחי של מכשיר מחלות כלי דם לעתים קרובות להזניח את החשיבות של דינמיקת קיר כלי עמידה או זרימת דם במחלת כלי דם שמסתבכת לעתים קרובות על ידי שינויים במורפולוגיה כלי ונכסים. לא אנגיופלסטיקה הבלון ולא תומכן לענות הסיבוך של קיר גמישות ^7. לכן, דוגמנות במבחנה של דם זורמת כתוצאה ממחלת עורקים וטיפולים חשובה בחקירת פתולוגיות מחלה ויעילות של טיפול בעתיד. בזאת, אנו מתארים שיטה של ​​שכפול זרימת דם פיזיולוגית ופתולוגיים שנועדה לקבוע את תגובת תא בpathol מחלת כלי דםogies. זרימת נוזל גורמת ללחץ גזירה בקיר הכלי, שהוא אות מכאנית חשובה בבריאות כלי שיט, המשפיע על כל התאים בתוך כלי הדם. כמה חיישנים מכאניים על האנדותל של כלי הדם לגזירת נוזל זוהו, כולל cilium העיקרי שמוצג במחקרים שנעשה לאחרונה לאנדותל mechanosensing ^8. פעילות תאי האנדותל ומורפולוגיה מושפעות מהירות זרימה, כיוון, וpulsatility. בנוסף, תא שריר חלק הגירה (SMC) יכולה להיות מושפעת על ידי mechano-אותות של מהירות זרימה נמוכה עד ⁹ נוזל ביניים, וגם יכולה להיות דרך האיתות אוטוקריני מתאי האנדותל באמצעות תגובתם לזרום וmechano-התמרה של זרימת אותות באמצעות ציטוקינים לשחרר ^10. תלות "המנה" של גזירה ממוצעת, PI, ואיתות אוטוקריני יכולה להיות גם תלות הדדית. לשם כך, קביעת תגובת תא כלי דם לגזירת נוזל עם "מינון" מגוון בתרבות monolayerאו שיתוף התרבות במבחנה יכולה לספק תובנות מכניסטית לשיפוץ כלי דם ולשפר את המחלה וחיזוי טיפול. מערכת הזרימה השתמשה בניסוי זה מורכב ממשאבת דם, מאגר אוויר זרימת דעיכת במעלה הזרם, מד זרימה במורד הזרם משמש רק במהלך התקנה ניסיונית, תרבית תאים במורד הזרם, תא זרימת לוחות מקבילים, ומאגר המדיה. בקרת הזרימה משתנה כלי דם כגון מתכוונים קצב זרימה, פעימות לדקה, וPI יכול להיות מושגת באמצעות קצב זרימת שליטה, תדירות דופק, והכנסה של לחץ דעיכת. משאבות דם פועמות זמינות עם עקירת שבץ משתנה, בתדירות שבץ מבוקרת, הנוגעות ישירות לאומרים קצב זרימת נפחית, ותדירות דופק. מבוא של מאגר אוויר בתוך זרימת המעגל מאפשר לדעיכת לחץ, צמצום גודל זרימת תנודה. תקשורת היא נוזל בלתי דחיס, בעוד אוויר בתוך חדר דעיכת הוא דחיסה, המאפשר לחץ עודף מזרימת הגל להיותנקלט על ידי דחיסת אוויר. האוויר ליחס תקשורת מאפשר שליטה על כמה דעיכת מתרחשת. תא זרימת תרבית תאים מותאם אישית 75 מ"מ באורך של 50 מ"מ ברוחב נוצר מאקריליק. הזרימה נכנסה דרך נמל הכניסה, ומרחיבה דרך סעפת היניקה, מתן זרימה עקבית בשלמות של תא הזרימה. זרימה ומבנים דומים נמצאות בתא שקע. תאים הם זורעים על גבי שקופיות פונקציונליות, ולאחר מכן מחובר לתא הזרימה. זה מאפשר לאוכלוסיות גדולות, לקח בקלות לאחר המחקר. ניסויי שיתוף התרבות יכולים להשתמש בקרום פוליקרבונט נקבובי לחסל מגע תא אל התא בין תרבויות, ובמקביל לאפשר ציטוקינים / זרימת תחבורה. מערכת זו בעבר שימשה מודל זרימה הגבוה PI והשפעתו על תרבות monolayer האנדותל ושיתוף תרבות EC / SMC ^{1, 10,} לחקור תא תגובה למחלה לצרכן גבוהה פתולוגית. בתיאור הפרוטוקול המשמש למודל הזרימה קון אלהditions, אנו מקווים לסייע לאחרים בקביעת תרומת זרימת אות לתא תגובה.

Protocol

1. Silanization וbiomolecule Functionalization של שקופיות או פוליקרבונט ממברנה

הערה: רבים מהכימיקלים והפתרונות בפרוטוקול זה שיעורי אידוי גבוהים (אתנול (EtOH), אצטון, וכו '). צעדים אחרים כרוכים פעמים דגירה ארוכות לשיעורי אידוי נמוכים. סרט פרפין מומלץ לאטום מכולות. זהירות: רבים של הכימיקלים (כולל: חומצה גופרתית, אצטון, (3-aminopropyl) triethoxysilane, glutaraldehyde, EtOH) נחשבים מסוכן, או הפכפך. התייעץ גיליון בטיחות חומרים (MSDS) של כל חומר לאחסון נאות, טיפול, ורשות לפני השימוש.

1. מניחים שקופית חדשה זכוכית מדידת 75 מ"מ ב -50 מ"מ על ידי מ"מ 1, ב, מנה מכתימה שקופיות זכוכית נקייה ללא קשר לנטייה, הבטחת טבילה מלאה. השתמש במכל לצעדים 1.1-1.12.
   קרום לתרבות משותפת, כולל פוליקרבונט (PC) עם 0.4 מיקרון גודל נקבובית, לחתוך לגודל של 75 מ"מ ב -50 מ"מ, לכל STE הבא: הערהנ.ב. לfunctionalization מחשב וזריעת EC.
2. לטבול את השקופית בחומצה גופרתית (20%), O / N.
   זהירות: התייעץ MSDS לחומצה גופרתית לפני השימוש.
3. לשטוף שקופיות ידי טבילה במים ללא יונים (DI) ל5 דקות, שלוש פעמים, שינוי DI בכל פעם.
4. לטבול את השקופית באצטון למשך 30 דקות.
   זהירות: התייעץ MSDS לאצטון לפני השימוש.
5. לטבול את השקופית ב6% O פתרון triethoxysilane / אצטון (3-aminopropyl) / N.
   זהירות: התייעץ MSDS לtriethoxysilane (3-aminopropyl) ואצטון לפני השימוש.
6. לטבול את השקופית באצטון ל5 דקות, שלוש פעמים, שינוי אצטון בכל פעם.
   זהירות: התייעץ MSDS לאצטון לפני השימוש.
7. לשטוף שקופיות ידי הטבילה בDI ל5 דקות, שלוש פעמים, שינוי DI בכל פעם.
8. לטבול את השקופית בשיעור של 1.5% פתרון glutaraldehyde / DI במשך 60 דקות.
   זהירות: התייעץ MSDS לglutaraldehyde לפני השימוש.
9. לשטוף שקופיות ידי הטבילה בDI ל5 דקות, שתי פעמים, שינוי DI בכל פעם.
10. שקופית מקוםשל 70% אתנול ל( EtOH) למשך 30 דקות בסטרילי, זרימה למינרית.
11. הסר EtOH ולאפשר נותרו שאריות להתאדות. לטבול את השקופיות בDI וניקוז סטרילי כדי רעננות השקופיות.
    הערה: שקופיות או קרום מחשב יכול להיות אטום בהחזיק שקופיות זכוכית ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד שבוע. על השימוש לתרבית תאים, חזור על שלבים 1.10 ו1.11.
12. הסר את השקופיות מהחזיק השקופיות ולמקם אותו לתוך 100 מ"מ על ידי 100 מ"מ צלחת פטרי רבוע בזרימה למינרית.
    הערה: מיכל זה ישמש לכל השלבים הנותרים.
    1. הכן שקופית או מחשב לזריעת תאי האנדותל לניסוי monoculture.
       1. מעיל השקופיות פונקציונליות או מחשב (שלב 1.11) עם פתרון 1 מיליליטר פיברונקטין (25 מיקרוגרם / מיליליטר), בצד אחד, המכסה את האזור המשוער שנחשף לתא תרבית תאים.
       2. דגירה שקופיות או מחשב בחממה סטרילית נקבעה על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות.
       3. לאחר דגירה, לשאוב את הפתרון שנותר באמצעות GLAפיפטה aspirator ss מחוברת לואקום.
          הערה: שקופיות יכולות עכשיו להיות מאוחסנים O / N ב 4 ° C לשימוש עתידי.
    2. עקוב 1.12.2 צעדים רק להכנת שיתוף תרבות EC / SMC. הכן וזרע תרבות חלקה תא שריר (SMC) לניסוי התרבות משותפת.
       1. אטם סיליקון מקום על גבי השקופית (שלב 1.11), עם ממדים של 75 מ"מ על ידי קוטר 50 מ"מ חיצוני, קוטר הפנימי של 50 מ"מ ב -30 מ"מ, עובי של 0.5 מ"מ, ונקבים שליישר עם זרימת תא ואקום.
       2. הכן 1 מיליליטר SMC ב 10% FBS השעיה / DMEM. לנטרל 1 מיליליטר פתרון של 2 מ"ג / מיליליטר קולגן סוג אני עם 7% NaHCO ₃ ו 0.1 פתרון M NaOH לpH של 7.4, ולערבב עם ההשעיה SMC עם צפיפות תא סופית של 2 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר.
       3. מורחים פתרון SMC בתוך אטם דגירה שקופיות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 30 דקות.
       4. לאחר דגירה, לכסות את השקופית עם סרום 25 מיליליטר 0.1% שור עוברי (FBS) מעורבת בDulbecco של שינוינשר בינוני (DMEM) במשך 72 שעות.
13. תאי האנדותל תרבות (ECs) על קרום שקופיות / פוליקרבונט זכוכית.
    1. זרע 1 ECs מיליליטר ב 10% FBS / DMEM, עם ריכוז ראשוני של 6.0 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר, על משטחי פיברונקטין של שקופיות זכוכית או קרום פוליקרבונט.
    2. דגירה תאים בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, ו -10% FBS 120 דקות.
    3. שקופיות כיסוי המכילות תאים עם תוספת של 10% FBS / DMEM, ומקום בחממה ב -37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ O / N, עד 70% -80% ומחוברות.

2. קביעת צמיגות נוזל ונפח קצב זרימה

הערה: viscometers סיבוב הוא ציוד רגיש, והמדריך למשתמש viscometer יש להתייעץ לפני הכיול, איפוס, או ביצוע מדידות.

1. לקבוע גזירה רצויה נוזל (τ) מהספרות של כלי הדם הממוקד של הניסוי.
2. MeasurFBS דואר 1% / צמיגות DMEM (μ), באמצעות viscometer סיבוב.
3. לקבוע קצב זרימת נפח הנדרש (Q) ממשוואה Poiseuille:
   ,
   שבו τ = גזירת נוזל, μ = צמיגות, Q = כרך. קצב זרימה, רוחב w = קאמרי, וh = קאמרי גובה).
4. משאבה מוגדרת קצב הזרימה נגזר בשלב 2.3, ולהשתמש לכל השלבים הבאים.

3. קביעת Pulsatility האינדקס

הערה: כל יציאות החיבור במערכת צריכה להיות מחוברות עם עקיצה נעילת טבעת לגודל מתאים, או חיבורי luer לעקיצה נקבה. צינורות PVC חיבור עשויים אז להיות מחוברים לאבזרי עקיצה, ומעגל הושלם.

1. חבר זרימת מעגל כמו באיור 2, עם דעיכת קאמרית (איור 3) ומד זרימה קולי בכיוון זרימה נכון.
   הערה: מד זרימת Ultrasonic הוא פיסת הציוד רגישה, והמדריך למשתמש יש להתייעץ לפני השימוש.
2. מלא זרימת מעגל ומאגר עם מים די, על ידי הבטחת צינור לשקע מאגר (לשאוב) הוא שקוע בתוך מאגר נפח. דמיין זרימת צורת גל באמצעות מד זרימה.
3. שסתום שחרור האוויר פתוח בתא דעיכת לשנות יחס נפח נוזל / אוויר. שסתום לסגור שחרור אוויר במרווחי מפלס נוזל שונים ולחשב מדד pulsatility (PI = (V _מקס - V _{מינ ')} / V _Mean) באמצעות זרימת שיא גל (V _מקס), שוקת (V _מינ'), ואומרים (V _{מתכוון).} ערכי PI רשומות במחברת.
4. מארק וכתוצאה מכך רמת נוזל וPI על חדר דעיכת, באמצעות הלבד הטה, עט דיו קבוע לשימוש עתידי. לקבוע רמות PI רצויות מהספרות פתולוגיה ^11.
5. Tube הסיליקון Formation- אופציונאלי, שיטה מתקדמת יותר של pulsatility שליטה
   1. מערבבים את בסיס אלסטומר סיליקון וסוכן ריפוי ביחסים שונים (לדוגמא, basיחס בין 10 דואר ל- crosslinker: 1 עד 36:. 1) למגוון moduli אלסטי הממוקד, כפי שמודגם בעבר ²
   2. לפברק צינורות סיליקון על ידי תהליך טבילה-תרופה חוזרת ונשנית, טבילה קצרה צינורית פלדה (14 G) לתערובת prepolymer סיליקון עם יחס הבסיס לcrosslinker שנקבע מראש.
   3. מניחים את הצינורית מצופה prepolymer לתנור על 60 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לרפא את ציפוי הפולימרים בצינורית, מיתוג הכיוון באמצע תהליך הריפוי.
   4. חזור על תהליך הטבילה באותה התערובת אלסטומר סיליקון ומניח בחזרה בתנור במשך 4 שעות נוספות, וכתוצאה מכך ~ 0.3 מ"מ צינורות עבים.
   5. הסר את צינור סיליקון Ultrathin מצינורית הנירוסטה.
   6. חבר צינורות לזרום במעגל במקום דעיכת קאמרית, וPI בדיקה עבור כל אחד כמו ב3.3.

עיקור 4. משאבה

1. לטבול את תא הזרימה (איור 2), צינורות PVC, ואטמים ב10% מי חמצן (H ₂ O _2). לשטוף עם DI סטרילי לפני שלב 4.
2. מניחים את משאבת הדם על מדף חממת חילוף.
   הערה: מדפי חממה צריכים להיות נירוסטה, ולהיות מסוגל לתמוך במשקל של כל מעגל הזרימה.
3. מלא את זרימת המעגל ומאגר עם 10% H ₂ O ₂ על ידי הבטחת צינור לשקע מאגר (לשאוב) הוא שקוע בתוך מאגר נפח. הפץ H ₂ O ₂ על ידי שאיבה באמצעות מעגל עבור 20 דקות בזרימה למינרית עם אור UV על.
4. לשאוב כל H ₂ O ₂ מצינורות, ולשטוף עם PBS סטרילי על ידי שאיבה באמצעות זרימת מעגל.

5. עצרת לשכת זרימה

הערה: תא הזרימה מורכב של אקריליק, צלחת מותאמת אישית, עם יציאות ואקום וכניסה וזרימה לשקע יציאות (ראה איור 2). הרכבה קאמרית מורכבת של הצבת תא הזרימה ואטמים על גבי שקופיות תרבות, פרוPerly מיושר, והוא מתואר להלן.

1. לחמם 1% FBS / DMEM באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולהכין תא זרימה.
   1. קח שקופיות EC מתקשורת (מצעד 1.13) ואטם מקום על גבי עם צד תא למעלה.
   2. (אופציונאלי) קרום מחשב קח את המדיה (מצעד 1.13) ואטם מקום על גבי עם צד תא למעלה. מניחים שקופית שיתוף תרבות עם זרע SMC (שלב 1.12.2) מתחת קרום מחשב.
2. יישר ערוץ ואקום של תא הזרימה עם החורים באטם (איור 2).
3. צרף צינור ואקום ליציאות ואקום (איור 2) להבטיח שום הדלפות לתקשורת לואקום.
4. גיליון פוליקרבונט מקום מתחת שקופיות זכוכית והרכבת תא זרימת מהדק עם מהדק האביב, אחד בכל צד של תא זרימה (איורים 2 ו 5).
5. מערכת זרימת מקום בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, ולמלא את המעגל עם תקשורת על ידי שאיבה ממאגר מלא בpulsatility הנמוך.לשמור על התזרים הזה במשך 4 שעות לנפשיים מראש תאים.
6. התאם נפח נוזל בדעיכה קאמרי לרמת PI הניכרת, ותרבות לזמן רצוי.

תוצאות

תחזוקה של תנאי זרימה היא סומך על הרכבה נכונה של זרימת המעגל (איור 1). צינורות בקוטר הוא בחירה חשובה בהרכבה, בקטרים ​​גדולים יותר צמצום זרימת התנגדות וירידה בלחץ הבא לפני ואחרי חדר התרבות. כדי להבטיח שנועדה מהירות לחץ וזרימה, להרכיב את המערכת עם מד זרימה לפני ?...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה של שכפול זרימה פועמת במבחנה, ועשוי להיות צעד ראשון סייע בקביעת תרומה של תנאי זרימה לפתולוגיות מחלה. המחקרים קודמים תוך שימוש בפרוטוקול זה מצאו תנאי זרימה לתרום לתגובה דלקתית בכלי הדם. ^{1, 10} בנוסף, פרוטוקול זה מיועד למעבדות מנוסים. ככזה, ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	34850
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	320501
(3-Aminopropyl)trethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G5882
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844
Glass Slide (70mm x 50mm)	Sigma-Aldrich	CLS294775X50
Polycarbonate Membrane	Millipore Corp.	HTTP09030
Silicone Gasket	Grace Bio-Labs	RD 475464
Fibronectin (25 μg/mL)	Sigma-Aldrich	F1141
Collagen Type-I	Sigma-Aldrich	C3867
NaHCO3	Fluka	36486
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
Damping Chamber			This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3.
Blood Pump	Harvard Apparatus	529552
Poly-Vinyl Carbonate Tubing	US Plastic	65066, 65063, 65062	Various sizes may be required
Luer Connections	Nordson Medical	Various	Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use.
Culture Chamber	Machined in-house	Custom	Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber
Square Petri Dish	Cole-Parmer	EW-14007-10
Glass Slide Holder	Capitol Scientific	WHE-900303
Fetal Bovine Serum	Mediatech, Inc.	35-010-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Mediatech, Inc.	10-013-CV
Flow Meter	Sonotec, GmbH	Sonoflow co.55/060
Sylgard Elastomer Kit	Sigma-Aldrich	761036-5EA
14 G Steel Cannula	General Laboratory Supply	S8365-1