In Vitro Modelo de fisiológicos e patológicos fluxo de sangue com aplicativos para Investigações de Reformas celular Vascular

Resumo

Este protocolo replica o fluxo sanguíneo fisiológico ou patológico in vitro para auxiliar na determinação da resposta celular em patologias de doenças. Com a introdução de uma pressão da câmara a jusante de uma bomba de sangue de amortecimento, o fluxo de sangue em toda a vasculatura pode ser recapitulada e que incide sobre uma monocamada de endotélio vascular ou de uma co-cultura mimética.

Resumo

A doença vascular é uma causa comum de morte nos Estados Unidos. Aqui, apresentamos um método para examinar a contribuição da dinâmica de fluxo em direção patologias doença vascular. Artérias saudáveis ​​apresentam frequentemente enrijecimento da parede, cicatrizes, ou estenose parcial que pode afetar as taxas de fluxo de fluido, e a magnitude do fluxo pulsátil, ou índice de pulsatilidade. Replicação de várias condições de fluxo é o resultado de uma pressão de ajuste de fluxo a jusante da câmara de uma bomba de sangue de amortecimento. A introdução de ar dentro de um sistema fechado permite que o fluxo de um meio compressível para amortecer a pressão pulsátil da bomba, e, por conseguinte, variar o índice de pulsatilidade. O método descrito aqui é simplesmente reproduzidas, com entrada altamente controlável, e os resultados facilmente mensuráveis. Algumas limitações são recriação da forma de onda de pulso fisiológico complexo, o que só é aproximado pelo sistema. As células endoteliais, células musculares lisas, fibroblastos e são afectados pelo fluxo de sangue thrOugh da artéria. A componente dinâmica de fluxo de sangue é determinada através da saída da parede arterial e complacência cardíaca. Vascular célula mecano-transdução de dinâmica de fluxo pode desencadear a liberação de citocinas e cross-talk entre tipos celulares dentro da artéria. Co-cultura de células vasculares é uma interacção mais preciso célula-célula imagem de reflexão sobre a parede do vaso sanguíneo e a resposta vascular à sinalização mecânica. Contribuição de dinâmica de fluxo, incluindo a resposta celular aos componentes dinâmicos e médios (ou equilíbrio) de fluxo, é, por conseguinte, uma métrica importante na determinação da patologia da doença e da eficácia do tratamento. Através da introdução de um modelo de co-cultura in vitro e pressão de amortecimento a jusante da bomba de sangue que produz o débito cardíaco simulado, diversas patologias de doença arterial podem ser investigadas.

Introdução

Taxas de morbidade para doenças cardiovasculares são a maior da América, com muitos resultante da vasculatura insalubre. As artérias saudáveis ​​consistem em tecido elástico, com a superfície luminal macia revestida com uma monocamada de células endoteliais (CE). Fluxo arterial pode ser modelado como uma função de onda oscilante com taxa média de fluxo positivo. O índice de pulsatilidade (PI) é o quociente de oscilação magnitude ea média de fluxo (PI = (Max. - Min.) / Média), ¹ e foi modelado in vitro com a elasticidade dos vasos variável ² Arterial elasticidade é importante no armazenamento do fluxo. energia a partir de contra....

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Protocolo

1. Silanização e biomolécula funcionalização de slide ou Policarbonato Membrana

Nota: Muitos dos produtos químicos e soluções no âmbito deste protocolo têm altas taxas de evaporação (etanol (EtOH), acetona, etc.). Outros passos implicam tempos de incubação longos para taxas de evaporação baixas. Parafina filme é recomendado para selar recipientes. Cuidado: Muitos dos produtos químicos (tais como: ácido sulfúrico, acetona, (3-aminopropil) trietoxissilano, glutaraldeído, EtOH) são considerados perigosos, ou volátil. Consultar ficha de segurança (FDS) de cada material para armazenamento, manuseio e descarte antes do uso.

1. ....

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Resultados

Manutenção de condições de fluxo é dependente de uma montagem correcta do circuito de fluxo (Figura 1). Tubulação de diâmetro é uma selecção importante na montagem, com diâmetros maiores diminuem a resistência do fluxo de queda de pressão e subsequente antes e depois da câmara de cultura. Para garantir a velocidade de pressão e fluxo pretendido, montar o sistema com medidor de fluxo antes de experimento com tubulação pretendido. Alinhamento de canal de vácuo câmara de cultura

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Discussão

Este protocolo descreve um método de reprodução de fluxo pulsátil in vitro, e pode ser o primeiro passo fundamental para determinar a contribuição de condições de fluxo para patologias de doenças. Estudos anteriores, usando este protocolo ter encontrado condições de fluxo de contribuir para a resposta inflamatória vascular. ^{1, 10} Além disso, este protocolo destina-se a laboratórios experientes. Como tal, nem em profundidade mecânica dos fluidos, nem análise bioquímica é aqui descrit.......

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	34850
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	320501
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G5882
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844
Glass Slide (70 mm x 50 mm)	Sigma-Aldrich	CLS294775X50
Polycarbonate Membrane	Millipore Corp.	HTTP09030
Silicone Gasket	Grace Bio-Labs	RD 475464
Fibronectin (25 μg/ml)	Sigma-Aldrich	F1141
Collagen Type-I	Sigma-Aldrich	C3867
NaHCO3	Fluka	36486
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
Damping Chamber			This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3.
Blood Pump	Harvard Apparatus	529552
Poly-Vinyl Carbonate Tubing	US Plastic	65066, 65063, 65062	Various sizes may be required
Luer Connections	Nordson Medical	Various	Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use.
Culture Chamber	Machined in-house	Custom	Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber.
Square Petri Dish	Cole-Parmer	EW-14007-10
Glass Slide Holder	Capitol Scientific	WHE-900303
Fetal Bovine Serum	Mediatech, Inc.	35-010-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Mediatech, Inc.	10-013-CV
Flow Meter	Sonotec, GmbH	Sonoflow co.55/060
Sylgard Elastomer Kit	Sigma-Aldrich	761036-5EA
14 G Steel Cannula	General Laboratory Supply	S8365-1