In Vitro Modelo de fisiológicos e patológicos fluxo de sangue com aplicativos para Investigações de Reformas celular Vascular

Resumo

Este protocolo replica o fluxo sanguíneo fisiológico ou patológico in vitro para auxiliar na determinação da resposta celular em patologias de doenças. Com a introdução de uma pressão da câmara a jusante de uma bomba de sangue de amortecimento, o fluxo de sangue em toda a vasculatura pode ser recapitulada e que incide sobre uma monocamada de endotélio vascular ou de uma co-cultura mimética.

Resumo

A doença vascular é uma causa comum de morte nos Estados Unidos. Aqui, apresentamos um método para examinar a contribuição da dinâmica de fluxo em direção patologias doença vascular. Artérias saudáveis ​​apresentam frequentemente enrijecimento da parede, cicatrizes, ou estenose parcial que pode afetar as taxas de fluxo de fluido, e a magnitude do fluxo pulsátil, ou índice de pulsatilidade. Replicação de várias condições de fluxo é o resultado de uma pressão de ajuste de fluxo a jusante da câmara de uma bomba de sangue de amortecimento. A introdução de ar dentro de um sistema fechado permite que o fluxo de um meio compressível para amortecer a pressão pulsátil da bomba, e, por conseguinte, variar o índice de pulsatilidade. O método descrito aqui é simplesmente reproduzidas, com entrada altamente controlável, e os resultados facilmente mensuráveis. Algumas limitações são recriação da forma de onda de pulso fisiológico complexo, o que só é aproximado pelo sistema. As células endoteliais, células musculares lisas, fibroblastos e são afectados pelo fluxo de sangue thrOugh da artéria. A componente dinâmica de fluxo de sangue é determinada através da saída da parede arterial e complacência cardíaca. Vascular célula mecano-transdução de dinâmica de fluxo pode desencadear a liberação de citocinas e cross-talk entre tipos celulares dentro da artéria. Co-cultura de células vasculares é uma interacção mais preciso célula-célula imagem de reflexão sobre a parede do vaso sanguíneo e a resposta vascular à sinalização mecânica. Contribuição de dinâmica de fluxo, incluindo a resposta celular aos componentes dinâmicos e médios (ou equilíbrio) de fluxo, é, por conseguinte, uma métrica importante na determinação da patologia da doença e da eficácia do tratamento. Através da introdução de um modelo de co-cultura in vitro e pressão de amortecimento a jusante da bomba de sangue que produz o débito cardíaco simulado, diversas patologias de doença arterial podem ser investigadas.

Introdução

Taxas de morbidade para doenças cardiovasculares são a maior da América, com muitos resultante da vasculatura insalubre. As artérias saudáveis ​​consistem em tecido elástico, com a superfície luminal macia revestida com uma monocamada de células endoteliais (CE). Fluxo arterial pode ser modelado como uma função de onda oscilante com taxa média de fluxo positivo. O índice de pulsatilidade (PI) é o quociente de oscilação magnitude ea média de fluxo (PI = (Max. - Min.) / Média), ¹ e foi modelado in vitro com a elasticidade dos vasos variável ² Arterial elasticidade é importante no armazenamento do fluxo. energia a partir de contracções do coração, dilatando sob pressão sistólica, e desempenha um papel importante na modulação PI do fluxo sanguíneo. Porque o coração mantém um consistente, pulsátil, fluxo volumétrico, a expansão arterial aumenta a área de corte transversal, o reforço da estabilidade do fluxo, reduzindo a velocidade do fluxo, tensão de cisalhamento e PI. Freqüentemente, as artérias saudáveis ​​apresentam alterações a elasticidadeou de conformidade, exibindo enrijecimento de remodelação vascular, tecido cicatricial ou calcificação ^{3, 4.} Além disso, outros distúrbios vasculares, tais como a hiperplasia neointimal (NIH), aneurisma ⁵ e ⁶ e hipertensão vascular fibrose ^4, pode contrair o diâmetro dos vasos. No entanto, o tratamento medicamentoso atual e tratamento de doenças vasculares dispositivo muitas vezes negligenciar a importância da dinâmica de conformidade da parede do vaso ou do fluxo sanguíneo na doença vascular que é muitas vezes complicada por alterações na morfologia navio e propriedades. Nem a angioplastia com balão, nem implante de stent responder a complicação da parede elasticidade ^7. Portanto, in vitro modelagem de fluxos de sangue resultante de doença arterial e tratamentos é importante na investigação de doenças e patologias futuro eficácia do tratamento. Aqui, nós descrevemos um método de replicar o fluxo sanguíneo fisiológico e patológico concebido para determinar a resposta de células na doença vascular Patholgias. O fluxo do fluido faz com que a tensão de cisalhamento na parede do vaso, que é um sinal mecânico importante na saúde dos vasos, que afecta todas as células no interior da vasculatura. Vários sensores mecânicos sobre o endotélio vascular de cisalhamento de fluidos, foram identificados, incluindo cílio primário mostrado em estudos recentes para endotelial mechanosensing ^8. A atividade das células endoteliais e morfologia são afetadas pela velocidade de fluxo, direção e pulsatilidade. Além disso, células do músculo liso (SMC) migração pode ser afectada por Mecano-sinais de baixa velocidade de fluxo através do fluido intersticial ^9, e pode também ser através da sinalização parácrina a partir de células endoteliais através da sua resposta ao fluxo e mecano-transdução de sinais de fluxo através de citocina liberar ^10. A "dose" dependência de cisalhamento média, PI, e sinalização parácrina também podem ser interdependentes. Para este fim, a determinação da resposta vascular à célula de cisalhamento de fluidos com "dosagem" variada em cultura em monocamadaou co-cultura in vitro poderiam fornecer insights mecanicistas em remodelação vascular e melhorar a doença e previsão de tratamento. O sistema de fluxo utilizado neste experimento consiste em uma bomba de sangue, um fluxo de amortecimento reservatório de ar a montante, um medidor de vazão a jusante apenas utilizado durante a configuração experimental, uma cultura de células a jusante, de placas paralelas câmara de fluxo, e media reservatório. Controle de variáveis ​​de fluxo vascular, tais como vazão média, batidas por minuto, e PI pode ser alcançada através do controlo do caudal, frequência de pulso, e introdução de pressão de amortecimento. Bombas de sangue pulsátil estão disponíveis com deslocamento variável acidente vascular cerebral, acidente vascular cerebral na freqüência controlada, directamente relacionadas com a taxa média de fluxo volumétrico, e frequência de pulso. Introdução de um reservatório de ar no interior do circuito de escoamento permite amortecimento de pressão, reduzindo a oscilação do fluxo de magnitude. Media é um fluido incompressível, enquanto o ar dentro da câmara de amortecimento é compressível, permitindo que o excesso de pressão a partir da onda de fluxo para serabsorvida pela compressão de ar. O ar à relação da mídia permite o controle sobre a forma como ocorre muito amortecimento. Um costume cultura de célula de fluxo câmara de 75 mm de comprimento por 50 mm de largura foi criado a partir de acrílico. Fluxo entra através da porta de entrada, e expande-se através do colector de entrada, fornecendo um fluxo consistente entre os elementos da câmara de escoamento. Fluxo e estruturas semelhantes estão presentes na saída da câmara. As células são semeadas em lâminas de funcionalizados, e subsequentemente ligados à câmara de fluxo. Isto permite uma grande população, facilmente recuperados após o estudo. Experiências de co-cultura pode utilizar uma membrana porosa de policarbonato para eliminar o contacto célula-a-célula entre as culturas, permitindo o transporte de citocina / fluxo. Este sistema foi anteriormente usado para modelar um elevado caudal de PI e o seu efeito sobre a cultura monocamada endotelial e CE / SMC co-cultura ^{1, 10,} para investigar a resposta celular à doença patologicamente elevada PI. Ao descrever o protocolo usado para modelar estes fluxo concondições, esperamos ajudar os outros para cálculo da contribuição de sinal para a célula de fluxo de resposta.

Protocolo

1. Silanização e biomolécula funcionalização de slide ou Policarbonato Membrana

Nota: Muitos dos produtos químicos e soluções no âmbito deste protocolo têm altas taxas de evaporação (etanol (EtOH), acetona, etc.). Outros passos implicam tempos de incubação longos para taxas de evaporação baixas. Parafina filme é recomendado para selar recipientes. Cuidado: Muitos dos produtos químicos (tais como: ácido sulfúrico, acetona, (3-aminopropil) trietoxissilano, glutaraldeído, EtOH) são considerados perigosos, ou volátil. Consultar ficha de segurança (FDS) de cada material para armazenamento, manuseio e descarte antes do uso.

1. Coloque nova lâmina de vidro medindo 75 mm por 50 mm até 1 mm, em limpo, lâmina de vidro coloração prato sem que respeita à orientação, garantindo imersão completa. Use o recipiente para as etapas 1.1-1.12.
   Nota: Para a co-cultura, incluem policarbonato (PC) com membrana de 0,4 micron de tamanho de poro, cortado no tamanho de 75 mm por 50 mm, para todas as Ste subsequenteps para a funcionalização PC e semeadura CE.
2. Imergir corrediça em ácido sulfúrico (20%), O / N.
   Atenção: Consulte o MSDS para ácido sulfúrico antes da utilização.
3. Lavar corrediça por imersão em água desionizada (DI), durante 5 minutos, três vezes, cada vez que a mudança DI.
4. Mergulhe de slides em acetona durante 30 min.
   Atenção: Consulte o MSDS para acetona antes da utilização.
5. Imergir corrediça em 6% (3-aminopropil) trietoxissilano solução / acetona O / N.
   Atenção: Consulte o MSDS para (3-aminopropil) trietoxissilano e acetona antes da utilização.
6. Imergir corrediça em acetona durante 5 minutos, três vezes, cada vez que a mudança de acetona.
   Atenção: Consulte o MSDS para acetona antes da utilização.
7. Lavar corrediça por imersão em DI durante 5 minutos, três vezes, cada vez que a mudança DI.
8. Mergulhe slide na solução de glutaraldeído / DI de 1,5% para 60 min.
   Atenção: Consulte o MSDS para o glutaraldeído antes do uso.
9. Lavar corrediça por imersão em DI durante 5 min, duas vezes, de cada vez mudar DI.
10. Lugar de slidess em 70% de etanol (EtOH) durante 30 min em estéril, câmara de fluxo laminar.
11. Remover EtOH e permitir resíduo restante evaporar. Imergir as lâminas em DI estéril e drenagem, a fim de hidratar os slides.
    Nota: As lâminas ou membrana de PC pode ser selado no suporte da lâmina de vidro e armazenada a 4 ° C até uma semana. Após a utilização de cultura de células, repita os passos 1.10 e 1.11.
12. Retirar a lâmina do suporte para slide e colocá-lo em um 100 mm em 100 mm placa de Petri quadrado na capela de fluxo laminar.
    Nota: Este recipiente vai ser usado para todas as etapas restantes.
    1. Prepare slide ou PC para a semeadura de células endoteliais para a experiência monocultura.
       1. Revestir a corrediça funcionalizado ou PC (passo 1.11) com 1 ml de solução de fibronectina (25 ug / ml), de um lado, que cobre a área aproximada exposto à câmara de cultura de células.
       2. Incubar as lâminas ou de PC numa incubadora esterilizada fixada em 37 ° C durante 1-2 horas.
       3. Após a incubação, aspirar a solução remanescente utilizando uma ABLss pipeta aspirador ligado a um vácuo.
          Nota: As lâminas podem agora ser armazenados O / N a 4 ° C para uso futuro.
    2. Siga 1.12.2 etapas somente para a preparação de co-cultura CE / SMC. Prepare e sementes célula muscular (SMC) cultura suave para co-cultura experimento.
       1. Junta de silicone lugar na parte superior da corrediça (passo 1.11), com as dimensões de 75 mm de diâmetro exterior por 50 mm, diâmetro interior de 50 mm por 30 mm, espessura de 0,5 mm, e perfurações que se alinham com vácuo câmara de fluxo.
       2. Prepare 1 mL de SMC em 10% de FBS / DMEM suspensão. Neutralizar 1 ml de solução de 2 mg / ml de colagénio tipo I, com _7% de NaHCO3 e solução de NaOH 0,1 M a pH de 7,4, e misturar com o SMC, com a suspensão de células final de densidade de 2 X 10 ⁶ células / ml.
       3. Espalhe solução SMC dentro da junta e incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 30 min.
       4. Após a incubação, cobrir a lâmina com 25 mL de soro 0,1% de bovino fetal (FBS) misturado em Dulbecco ModificadoEagle Médium (DMEM) durante 72 h.
13. Células endoteliais Cultura (ECS) na membrana de vidro deslizante / policarbonato.
    1. Semente 1 ml CEs em 10% de FBS / DMEM, com a concentração inicial de 6,0 x 10 ⁵ células / ml, em superfícies de fibronectina de lâmina de vidro ou membrana de policarbonato.
    2. Incubar as células em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO _2, e 10% de FBS durante 120 min.
    3. Tampa desliza contendo células com FBS a 10% adicional / DMEM, e no lugar na incubadora a 37 ° C, 5% de CO ₂ O / N, até 70% -80% confluente.

2. A determinação da viscosidade do fluido e Volumétrica Vazão

Nota: viscosímetros rotativos são equipamentos sensíveis, e o manual do usuário viscometer deve ser consultado antes de calibrar, zerando, ou realizar medições.

1. Determinar cisalhamento de fluido desejado (τ) de literatura da vasculatura alvo do experimento.
2. MEASURe 1% de FBS / DMEM viscosidade (μ), usando um viscosímetro rotacional.
3. Determinar necessário caudal volumétrico (Q) a partir da equação de Poiseuille:
   ,
   onde τ = cisalhamento de fluido, μ = viscosidade, Q = vol. caudal, largura w = câmara, e h = altura da câmara).
4. Definir a taxa de bomba derivado no passo 2.3 fluir, e usar para todas as etapas subseqüentes.

3. Determinação do índice de pulsatilidade

Nota: Todas as portas de ligação dentro do sistema deve ser ligado com o anel de bloqueio farpa-a-apropriadamente dimensionado, ou ligações luer-para-feminino farpa. Ligar a tubagem de PVC pode então ser ligado a boquilha, e o circuito completado.

1. Ligue o circuito de fluxo, como na Figura 2, com a câmara (Figura 3) e medidor de fluxo ultra-sónica de amortecimento na direcção correcta do fluxo.
   Nota: medidor de fluxo ultra-som é uma peça sensível do equipamento, eo manual do usuário deve ser consultado antes do uso.
2. Preencha circuito de fluxo e reservatório com água DI, assegurando tubo de saída do reservatório (a bomba) está submerso dentro do volume do reservatório. Visualize forma de onda de fluxo utilizando um medidor de vazão.
3. Válvula de liberação de ar livre, na câmara de amortecimento para alterar a proporção do volume de fluido / ar. Fechar a válvula de liberação de ar em diferentes intervalos de nível de fluido e calcular o índice de pulsatilidade (PI = (V _{Max -} V _Min) / V _Média) usando pico da forma de onda de fluxo (V _Max), calha (V _min), ea média (V _Média). Valores de PI recordes no notebook.
4. Mark resultante nível de fluido e PI na câmara de amortecimento, usando um feltro com ponta, caneta de tinta permanente para uso futuro. Determinar os níveis desejados de PI patologia literatura ^11.
5. Tubo de silicone formação- Opcional, o método mais avançado de controle de pulsatilidade
   1. Misture a base de elastómero de silicone e o agente de cura em diferentes proporções (por exemplo, um baixorazão E-para-agente de reticulação a partir de 10: 1 a 36: 1.) para módulos elásticos orientadas variaram, conforme ilustrado anteriormente ²
   2. Fabricar tubos de silicone por repetidas processo de imersão-cura, imergindo brevemente cânula de aço (14 g) à mistura de pré-polímero de silicone com uma proporção predeterminada de base-para-agente de reticulação.
   3. Coloque a cânula revestida de pré-polímero num forno regulado para 60 ° C durante 4 horas para curar o revestimento de polímero sobre a cânula, a mudança da direcção no meio do processo de cura.
   4. Repetir o processo de imersão com a mesma mistura de elastómero de silicone e coloque novamente no forno durante 4 horas adicionais, o que resulta em ~ 0,3 mm de espessura tubos.
   5. Remover o tubo de silicone ultrafina da cânula de aço inoxidável.
   6. Ligue os tubos de fluxo de circuito em vez de câmara de amortecimento, e teste de PI para cada como em 3.3.

4. Esterilização Bomba

1. Imergir a câmara de fluxo (Figura 2), tubos de PVC, e juntas de 10% de peróxido de hidrogénio (H _{2 O 2).} Lavar com DI estéril antes da etapa 4.
2. Coloque a bomba de sangue em uma prateleira incubadora de reposição.
   Nota: prateleiras incubadora deve ser de aço inoxidável, e ser capaz de suportar o peso de todo o circuito de fluxo.
3. Encher o reservatório de circuito de fluxo e com 10% de H _{2 O 2,} assegurando tubo de saída do reservatório (a bomba) está submerso dentro do volume de reservatório. Circular _{H2O 2} por bombeamento através do circuito, durante 20 minutos na câmara de fluxo laminar com luz UV em.
4. Aspire todo o H _{2 O 2} a partir de tubos, e lavar com PBS estéril por bombagem através do circuito de fluxo.

5. Conjunto de câmara de Fluxo

Nota: A câmara de fluxo é constituído de um acrílico, feito à medida placa, com orifícios de vácuo e orifícios de entrada e de saída de fluxo (ver Figura 2). Conjunto de câmara consiste em colocar a câmara de escoamento e juntas na parte superior de lâminas de cultura, próperly alinhados, e é descrito abaixo.

1. Aqueça 1% FBS / DMEM num banho de água a 37 ° C e preparar câmara de fluxo.
   1. Tome slides CE fora dos meios de comunicação (a partir do passo 1.13) e local junta na parte superior com o lado célula para cima.
   2. (Opcional) Leve membrana PC sem mídia (do passo 1.13) e local junta na parte superior com o lado célula para cima. Coloque co-cultura de slides com semeado SMC (passo 1.12.2) por baixo da membrana PC.
2. Alinhar canal de vácuo da câmara de fluxo com os orifícios no vedante (Figura 2).
3. Anexar tubo de vácuo para portas de vácuo (Figura 2) garantindo que não haja vazamentos de mídia a vácuo.
4. Local folha de policarbonato debaixo lâmina de vidro e o conjunto da câmara de fluxo de braçadeira com grampos de mola, uma em cada lado da câmara de fluxo (Figuras 2 e 5).
5. Coloque o sistema de fluxo, numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2, e encher o circuito com meios de bombagem por reservatório enchido com baixo pulsatilidade.Manter este fluxo durante 4 horas para pré-condicionamento células.
6. Ajustar o volume de fluido na câmara de amortecimento para o nível PI marcado e cultura para o tempo desejado.

Resultados

Manutenção de condições de fluxo é dependente de uma montagem correcta do circuito de fluxo (Figura 1). Tubulação de diâmetro é uma selecção importante na montagem, com diâmetros maiores diminuem a resistência do fluxo de queda de pressão e subsequente antes e depois da câmara de cultura. Para garantir a velocidade de pressão e fluxo pretendido, montar o sistema com medidor de fluxo antes de experimento com tubulação pretendido. Alinhamento de canal de vácuo câmara de cultura

Discussão

Este protocolo descreve um método de reprodução de fluxo pulsátil in vitro, e pode ser o primeiro passo fundamental para determinar a contribuição de condições de fluxo para patologias de doenças. Estudos anteriores, usando este protocolo ter encontrado condições de fluxo de contribuir para a resposta inflamatória vascular. ^{1, 10} Além disso, este protocolo destina-se a laboratórios experientes. Como tal, nem em profundidade mecânica dos fluidos, nem análise bioquímica é aqui descrit...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	34850
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	320501
(3-Aminopropyl)trethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G5882
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844
Glass Slide (70mm x 50mm)	Sigma-Aldrich	CLS294775X50
Polycarbonate Membrane	Millipore Corp.	HTTP09030
Silicone Gasket	Grace Bio-Labs	RD 475464
Fibronectin (25 μg/mL)	Sigma-Aldrich	F1141
Collagen Type-I	Sigma-Aldrich	C3867
NaHCO3	Fluka	36486
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
Damping Chamber			This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3.
Blood Pump	Harvard Apparatus	529552
Poly-Vinyl Carbonate Tubing	US Plastic	65066, 65063, 65062	Various sizes may be required
Luer Connections	Nordson Medical	Various	Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use.
Culture Chamber	Machined in-house	Custom	Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber
Square Petri Dish	Cole-Parmer	EW-14007-10
Glass Slide Holder	Capitol Scientific	WHE-900303
Fetal Bovine Serum	Mediatech, Inc.	35-010-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Mediatech, Inc.	10-013-CV
Flow Meter	Sonotec, GmbH	Sonoflow co.55/060
Sylgard Elastomer Kit	Sigma-Aldrich	761036-5EA
14 G Steel Cannula	General Laboratory Supply	S8365-1